Molekulêre diagnose tegnologie gebruik molekulêre biologie metodes om die uitdrukking en struktuur van die genetiese materiaal van die menslike liggaam en verskeie patogene op te spoor, om sodoende die doel te bereik om siektes te voorspel en te diagnoseer.

In onlangse jare, met die opgradering en herhaling van molekulêre diagnostiese tegnologie, het die kliniese toepassing van molekulêre diagnostiek meer en meer uitgebrei en in diepte geword, en die molekulêre diagnostiese mark het 'n tydperk van vinnige ontwikkeling betree.

Die skrywer som die algemene molekulêre diagnostiese tegnologieë op die mark op, en word in drie dele verdeel: die eerste deel stel die PCR-tegnologie bekend, die tweede deel stel die nukleïensuur isotermiese amplifikasie-tegnologie bekend, en die tweede deel stel die volgordebepalingstegnologie bekend.

01

Deel I: PCR Tegnologie

PCR tegnologie

PCR (polimerase kettingreaksie) is een van die in vitro DNA amplifikasie tegnologieë, met 'n geskiedenis van meer as 30 jaar.

PCR-tegnologie is in 1983 deur Kary Mullis van Cetus, VSA, begin.Mullis het in 1985 om 'n PCR-patent aansoek gedoen en in dieselfde jaar die eerste PCR akademiese referaat oor Wetenskap gepubliseer.Mullis het in 1993 die Nobelprys in Chemie gewen.

Basiese Beginsels van PCR

PCR kan teiken-DNA-fragmente met meer as een miljoen keer versterk.Die beginsel is dat onder die katalise van DNA-polimerase, die ouerstreng DNA as 'n sjabloon gebruik word, en 'n spesifieke primer word gebruik as die beginpunt vir verlenging.Dit word in vitro herhaal deur stappe soos denaturering, uitgloeiing en verlenging.Die proses van dogterstring-DNA komplementêr tot die ouerstring-sjabloon-DNA.

Die standaard PCR-proses word in drie stappe verdeel:

1. Denaturering: Gebruik hoë temperatuur om DNA-dubbelstringe te skei.Die waterstofbindings tussen DNA-dubbelstringe word by hoë temperature (93-98°C) verbreek.

2. Uitgloeiing: Nadat die dubbelstring DNA geskei is, word die temperatuur verlaag sodat die primer aan die enkelstring DNA kan bind.

3. Uitbreiding: Die DNS-polimerase begin komplementêre stringe langs die DNS-stringe te sintetiseer vanaf die primers wat gebind word wanneer die temperatuur verlaag word.Wanneer die uitbreiding voltooi is, word 'n siklus voltooi, en die aantal DNA-fragmente verdubbel.

Deur hierdie drie stappe 25-35 keer te herhaal, sal die aantal DNA-fragmente eksponensieel toeneem.

Die vernuf van PCR is dat verskillende primers vir verskillende teikengene ontwerp kan word, sodat die teikengeenfragmente in 'n kort tydperk geamplifiseer kan word.

Tot dusver kan PCR in drie kategorieë verdeel word, naamlik gewone PCR, fluoresserende kwantitatiewe PCR en digitale PCR.

Die eerste generasie van gewone PCR

Gebruik 'n gewone PCR amplifikasie instrument om die teiken geen te amplifiseer, en gebruik dan agarose gel elektroforese om die produk op te spoor, slegs kwalitatiewe analise kan gedoen word.

Die belangrikste nadele van die eerste generasie PCR:

-Geenig tot nie-spesifieke amplifikasie en vals positiewe resultate.

-Die opsporing neem lank en die operasie is omslagtig.

-Slegs kwalitatiewe toetsing kan gedoen word.

Tweede generasie fluoressensie kwantitatiewe PCR

Fluoresensie kwantitatiewe PCR (Real-Time PCR), ook bekend as qPCR, word gebruik om die ophoping van geamplifiseerde produkte te monitor deur die ophoping van fluoresserende seine deur fluoresserende probes by te voeg wat die vordering van die reaksiestelsel kan aandui, en om die resultate deur die fluoressensiekurwe te beoordeel, en Dit kan gekwantifiseer word met die standaardkrommewaarde en hulp.

Omdat die qPCR-tegnologie in 'n geslote sisteem uitgevoer word, word die waarskynlikheid van kontaminasie verminder, en die fluoressensiesein kan gemonitor word vir kwantitatiewe opsporing, dus is dit die algemeenste in die kliniese praktyk en het die dominante tegnologie in PCR geword.

Die fluoresserende stowwe wat in intydse fluoresserende kwantitatiewe PCR gebruik word, kan verdeel word in: TaqMan fluoresserende probes, molekulêre bakens en fluoresserende kleurstowwe.

1) TaqMan fluoresserende sonde:

Tydens PCR-amplifikasie word 'n spesifieke fluoresserende sonde bygevoeg terwyl 'n paar primers bygevoeg word.Die sonde is 'n oligonukleotied, en die twee ente is onderskeidelik gemerk met 'n verslaggewer fluoresserende groep en 'n blus fluoresserende groep.

Wanneer die sonde ongeskonde is, word die fluoresserende sein wat deur die verslaggewergroep uitgestraal word deur die blusgroep geabsorbeer;tydens PCR-amplifikasie, klief en degradeer die 5'-3'-eksonuklease-aktiwiteit van Taq-ensiem die sonde, wat die verslaggewer fluoresserende groep en uitdoof maak. Die fluoresserende groep word geskei, sodat die fluoressensie-moniteringstelsel die fluoressensie-sein kan ontvang, dit wil sê elke keer as 'n DNA-string gefluoreer word, gefluoreer word en die fluorescerende string opgehoop word. cence sein is heeltemal gesinchroniseer met die vorming van die PCR-produk.

2) SYBR fluoresserende kleurstowwe:

In die PCR-reaksiesisteem word 'n oormaat SYBR fluoresserende kleurstof bygevoeg.Nadat die SYBR-fluoresserende kleurstof nie-spesifiek in die DNA-dubbelstring geïnkorporeer is, gee dit 'n fluoresserende sein uit.Die SYBR-kleurstofmolekule wat nie in die ketting geïnkorporeer is nie, sal geen fluoresserende sein uitstraal nie, waardeur die fluoresserende sein verseker word. Die toename in PCR produkte is heeltemal gesinchroniseer met die toename in PCR produkte.SYBR bind slegs aan dubbelstring-DNS, dus kan die smeltkurwe gebruik word om te bepaal of die PKR-reaksie spesifiek is.

3) Molekulêre bakens

Dit is 'n stam-lus dubbel-gemerkte oligonukleotied sonde wat 'n haarnaaldstruktuur van ongeveer 8 basisse aan die 5 en 3 punte vorm.Die nukleïensuurvolgordes aan beide kante is komplementêr gepaard, wat veroorsaak dat die fluoresserende groep en die blusgroep styf is.Naby, dit sal nie fluoressensie produseer nie.

Nadat die PCR-produk gegenereer is, tydens die uitgloeiingsproses, word die middelste deel van die molekulêre baken met 'n spesifieke DNS-volgorde gepaar, en die fluoresserende geen word van die uitblusgeen geskei om fluoressensie te produseer.

Die belangrikste nadele van tweede generasie PCR:

Sensitiwiteit ontbreek steeds, en die opsporing van monsters met 'n lae kopie is nie akkuraat nie.

Daar is agtergrondwaarde-invloed, en die resultaat is vatbaar vir inmenging.

Derde generasie digitale PCR

Digitale PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) bereken die kopiegetal van die teikenvolgorde deur eindpuntopsporing, en kan akkurate absolute kwantitatiewe opsporing uitvoer sonder om interne kontroles en standaardkurwes te gebruik.

Digitale PCR gebruik eindpuntopsporing en is nie afhanklik van die Ct-waarde (siklusdrempel nie), dus word die digitale PCR-reaksie minder deur die versterkingsdoeltreffendheid beïnvloed, en die toleransie vir PCR-reaksie-inhibeerders word verbeter, met hoë akkuraatheid en reproduceerbaarheid.

As gevolg van die kenmerke van hoë sensitiwiteit en hoë akkuraatheid, word dit nie maklik deur PCR-reaksie-inhibeerders ingemeng nie, en dit kan ware absolute kwantifisering bereik sonder standaardprodukte, wat 'n navorsings- en toepassingshotspot geword het.

Volgens die verskillende vorme van die reaksie-eenheid kan dit in drie tipes verdeel word: mikrovloeistof-, skyfie- en druppelstelsels.