1. Bespeur die absorpsie van RNA-oplossing
Absorbansie by 280, 320, 230 en 260 nm verteenwoordig die waardes van onderskeidelik nukleïensuur, agtergrond (oplossingtroebelheid), soutkonsentrasie en organiese materiaal soos proteïen.Kyk gewoonlik net na OD260/OD280 (Verhouding, R).Wanneer 1.8~2.0, dink ons dat die kontaminasie van proteïen of ander organiese materiaal in RNA geduld kan word, maar daar moet kennis geneem word dat wanneer Tris as die buffer gebruik word om die absorpsie op te spoor, die R-waarde groter as 2 kan wees (gewoonlik moet dit <2.2 wees).Wanneer R<1.8 is die besoedeling van proteïen of ander organiese materiaal in die oplossing duideliker, en die lot van die RNA kan volgens die behoeftes bepaal word.Wanneer R>2.2 beteken dit dat RNA in enkelnukleïensuur gehidroliseer is.
2. Elektroforetiese patroon van RNA
Oor die algemeen word denaturerende gel vir RNA-elektroforese gebruik, maar as dit net is om die kwaliteit van RNA op te spoor, is denaturerende gel nie nodig nie, en gewone agarose-gel kan gebruik word.Die doel van elektroforese is om die integriteit van 28S- en 18S-bande en hul verhouding, of die integriteit van mRNA-smeer, op te spoor.Oor die algemeen, as die 28S- en 18S-bande helder, duidelik en skerp is (verwys na die rande van die bande is duidelik), en die helderheid van 28S is meer as twee keer dié van die 18S-band, beskou ons die kwaliteit van die RNA as goed.
Bogenoemde is die twee metodes wat ons algemeen gebruik, maar nie een van hierdie twee metodes kan duidelik vir ons sê of daar oorblywende RNase in die RNA-oplossing is nie.As daar 'n baie klein hoeveelheid RNase in die oplossing is, is dit moeilik vir ons om dit op te spoor met die bogenoemde metode, maar die meeste van die daaropvolgende ensiematiese reaksies word uitgevoer by bo 37 grade en vir 'n lang tyd.Op hierdie manier, as daar 'n baie klein hoeveelheid RNase in die RNA-oplossing is, sal daar 'n baie geskikte omgewing en tyd wees om hul rol in die daaropvolgende eksperimente te speel, en natuurlik sal die eksperiment op hierdie tydstip koud wees.Hieronder stel ons 'n metode bekend wat kan bevestig of daar oorblywende RNase in die RNA-oplossing is.
3. Hittebewaringstoets
Volgens die monsterkonsentrasie, trek twee 1000 ng RNA uit die RNA-oplossing en voeg dit by 'n 0.5 ml sentrifugebuis, en vul dit aan met pH 7.0 Tris buffer tot 'n totale volume van 10 ul, en verseël dan die dop van die buis.Plaas een van hulle in 'n konstante temperatuur waterbad by 70°C en hou dit warm vir 1 uur.Die ander deel is vir 1 uur in 'n -20°C yskas gestoor.Wanneer die tyd verby is, verwyder die twee monsters vir elektroforese.Nadat die elektroforese voltooi is, vergelyk die elektroforetiese bande van die twee.As die bande van die twee konsekwent is of geen noemenswaardige verskil het nie (natuurlik voldoen hul bande ook aan die voorwaardes in metode 2), beteken dit dat daar geen oorblywende RNase-kontaminasie in die RNA-oplossing is nie, en die kwaliteit van die RNA is baie goed.Inteendeel, as die monster wat by 70°C geïnkubeer is duidelike afbraak toon, dui dit aan dat daar RNase-kontaminasie in die RNA-oplossing is.
2 Eksperimentele metodes en tegnieke vir RNA-ekstraksie
Die probleme wat ons dikwels teëkom wanneer RNA onttrek word, is: (1) RNA-opbrengs is laag;(2) RNA het ernstige soutbesoedeling;(3) RNA het ernstige organiese oplosmiddelbesoedeling;(4) monster agteruitgang en ander probleme
1. Algemeen gebruikte totale RNA ekstraksie reagense
Die guanidien-isotiosianaat-metode en die Trizol-metode is die mees gebruikte metodes vir die onttrekking van totale RNA uit diereweefsels en dierselle.Dit is veral geskik vir klein monsters en weefsels wat besonder moeilik is om te onttrek, soos die onttrekking van totale RNA uit konynvel en dierebindweefsel;daarbenewens kan Trizol, as 'n algemene lisreagens, ook gebruik word vir die ekstraksie van plantweefsels, bakterieë, swamme en ander weefsels.Vir plantweefsels wat polisakkariede en polifenole bevat, soos camellia oleifera, teeblare, raapsaad, ens., kan die CTAB-metode ook gebruik word om totale RNA te onttrek.
As 'n konvensionele metode is die dubbelkolommetode ook baie gewild as gevolg van sy normale temperatuurwerking, geen behoefte om RNase by te voeg nie, en veiligheid—geen chloroform, fenole en ander organiese reagense vir ekstraksie nie.(aanbevole produkte )
2. Onttrekking van totale RNA uit diereweefsel
(1) Probeer om vars weefsel te kies, as dit nie vars is nie (verkieslik binne drie maande - 80 ℃ yskas of gevries in vloeibare stikstof. Wanneer weefsel gesny word, moenie direk by kamertemperatuur sny nie, maak seker dat jy dit op die ysboks sit, probeer om herhaalde vries en ontdooiing te vermy.
(2) Gebruik skoon skêr en pincet om 'n klein stukkie weefsel te sny, probeer om die sentrale deel van die weefsel te sny wanneer die monster gesny word, of sny eers die groot stukkie weefsel van die middel af, en sny dan die monster by die vars insnydingsposisie.Die verwyderde weefsel moet ten volle versnipper word, plaas die gekerfde weefsel in 'n EP-buis sonder RNase, voeg die lysaat by, die gekerfde weefsel moet ten volle aan die lysaat blootgestel word, en berei voor vir homogenisering.
(3) Vir normale weefsels, kies mungboontjie-grootte weefsels (30-60 mg) vir homogenisering.As die weefsels 'n groot hoeveelheid proteïene, vet of digte veselagtige weefsels soos lewer bevat, verhoog of verminder die hoeveelheid gesnyde weefsels toepaslik (opsioneel) Kies 10~20 mg).
(4) Indien visspiere, garnalevleis, jellievisse en ander weefsels met 'n hoë waterinhoud onttrek word, moet die monstervolume gepas verhoog word (aanbeveel 100-200 mg).
(5) Indien toestande dit toelaat, kan die diereweefsel direk onttrek word nadat dit gehomogeniseer is met 'n hoë-deurlaat weefsel homogeniseerder, indien daar nie sodanige toerusting is nie.
(6) Die RNA wat na die finale ekstraksie verkry is, moet onmiddellik op die yskas geplaas word om die afbraak van RNA te verminder.
3. Diersel RNA ekstraksie
(1) Suspensieselle: sentrifugeer direk en gooi die medium weg, was 1-2 keer met steriele PBS, suspendeer dan met 'n toepaslike hoeveelheid PBS, en voeg dan lysaat by vir lise.Moenie die lysaat direk by die gepresipiteerde selle voeg nadat die vloeistof heeltemal weggegooi is nie.Dit sal veroorsaak dat die histoonpakket wat vrygestel word na die geliseerde selle op die buitenste laag aan die buitekant van die gepresipiteerde selle kleef, en sodoende die kontak van die selle binne die korrel met die lysaat beperk., wat lei tot onvolledige sellise en verminderde RNA-opbrengs.
(2) Selle wat semi-klewend of nie styf klewerend is nie: Nadat die medium weggegooi is, was met PBS vir 1-2 keer, absorbeer dan direk 'n gepaste hoeveelheid PBS en blaas die kultuurskottel met 'n pipet of geweer om die selle af te blaas, en dra dit oor na RNA-vrye selle.Voeg die lysaat by die EP-buis van die ensiem vir ekstraksie.
(3) Adherente selle: moet eers met tripsien verteer word, dan in RNase-vrye EP-buise versamel word, gesentrifugeer word om die supernatant te verwyder, 1-2 keer met PBS gewas om oortollige tripsien te verwyder, en hersuspendeer met 'n toepaslike hoeveelheid PBS Gaan dan voort na die ekstraksiestap.
4. Plant-RNA-ekstraksie
Plantweefsels is ryk aan fenoliese verbindings, of ryk aan polisakkariede, of bevat 'n paar ongeïdentifiseerde sekondêre metaboliete, of het 'n hoë aktiwiteit van RNase.Hierdie stowwe word styf met RNA gekombineer na sellise om onoplosbare komplekse of kolloïdale neerslae te vorm, wat moeilik is om te verwyder.Daarom, wanneer ons plantweefsel onttrek, moet ons 'n kit vir plante kies.Die lysaat in die kit kan die probleme van maklike oksidasie van polifenole en skeiding van polisakkariedverbindings en nukleïensure effektief oplos.
(Vir polisakkaried polifenol plant RNA ekstraksie, aanbevole produkte:
(1) Die skil, pulp, sade, blare, ens. van die plant moet volledig in 'n vysel gemaal word.Tydens die maalproses moet vloeibare stikstof betyds aangevul word om te verhoed dat die monster smelt.Die grondmonster moet vinnig by die lysaat gevoeg en geskud word om RNA-afbraak te vermy.
(2) Vir veselryke monsters soos rys en koringblare, moet die hoeveelheid ekstraksie toepaslik verminder word, anders sal die weefselmaal en lisis nie volledig wees nie, wat lei tot 'n lae opbrengs van geëkstraheerde RNA.
(3) Vir plantweefsels met 'n hoë waterinhoud, soos granaatvrugte, waatlemoenvrugte, perskevrugte, ens., moet die monstergrootte gepas vergroot word (100-200 mg is opsioneel).
(4) Plantweefsels, soos plantblare, risome, harde vrugte en ander materiale word oor die algemeen aanbeveel om vloeibare stikstof te gebruik om die bestanddele deeglik in 'n mortel te mortel, en dan voort te gaan na die ekstraksiestap.Konvensionele weefselhomogeniseerders is dalk nie effektief in die homogenisering van plantweefsels nie, en word oor die algemeen nie aanbeveel nie.
5. Voorsorgmaatreëls vir RNA-ekstraksie
(1) Weefselmonsters moet so vars as moontlik wees om herhaalde bevriesing en ontdooiing te voorkom.
(2) Die weefsel moet ten volle gemaal word tydens ekstraksie, en die hoeveelheid weefsel moet nie te min wees nie, wat nog te sê te veel.
(3) Voldoende inkubasietyd moet gegee word nadat die lysaat bygevoeg is om die monster volledig te lyseer.
(4) Wanneer die Trizol-metode vir ekstraksie gebruik word, is die beginsel om die supernatant na stratifikasie te absorbeer "voorkeur om minder as meer in te asem", en moet nie na die middellaag onttrek nie, anders sal dit ernstige genomiese DNA-besmetting veroorsaak.
(5) Wanneer dit gewas word, moet die wasvloeistof heeltemal om die buiswand infiltreer om deeglike was te verseker.
(6) Vir die kolomekstraksiemetode moet die adsorpsiekolom, benewens die losmaak van die kolom na was, ook in 'n ultraskoon bank geplaas word en vir 5-10 minute geblaas word om die organiese oplosmiddel heeltemal tot droog te verdamp.
(7) By die laaste eluering van die kolommetode, nadat DEPC-water bygevoeg is, moet dit vir 3-5 minute geïnkubeer word, of die DEPC-water moet vooraf verhit word tot 60°C om die elueringsopbrengs te verhoog.In die tradisionele Trizol-splyting en isopropanol-presipitasiemetode word die finale RNA in DEPC-water opgelos, dus moet 'n gepaste tyd gegee word vir ontbinding, en die onderkant van die sentrifugebuis moet voortdurend met 'n pipetpunt geblaas word.
3 Tdrie oorsake en oplossings vir lae RNA-konsentrasie/swak kwaliteit
1. Die opbrengs is te laag
Die onttrek monster is te laag, die totale hoeveelheid is onvoldoende, of die onttrek monster is te veel en die lise is nie volledig nie;die weefsel of selle van toepaslike kwaliteit moet vir ekstraksie gebruik word, die voorbehandeling van die monster moet goed gedoen word, en die lise moet voldoende wees.
2. Genoomresidue
Wanneer die Trizol-metode onttrek word, wanneer die supernatant in die middelste laag ingesuig word na lae, sal ernstige genoombesmetting veroorsaak word;ekstra versigtigheid moet gedra word wanneer lae geplaas word om te verhoed dat dit in die middelste laag ingesuig word.As die kolommetode vir ekstraksie gebruik word, kan 'n stel wat DNase I bevat vir ekstraksie gekies word.Die nukleïensuur wat op die membraan geadsorbeer word, word direk met DNase I verteer, wat DNA-reste grootliks kan verminder.
3. RNA-afbraak
Dit kan die agteruitgang van die onttrekte monster self wees, of die agteruitgang wat tydens die ekstraksieproses veroorsaak word;sover moontlik moet vars monsters vir RNA-ekstraksie gebruik word, en die versamelde monsters moet betyds in vloeibare stikstof of -80°C yskas gestoor word, en herhaalde bevriesing en ontdooiing moet vermy word.RNase/DNase-vrye punte, sentrifugeerbuise en ander materiale moet in die RNA-ekstraksieproses gebruik word.Die onttrekkingsproses moet so vinnig as moontlik wees.Die onttrekte RNA moet op 'n yskas geplaas word en by -80 betyds gestoor word.Indien die geëkstraheerde RNA deur gelelektroforese opgespoor moet word, moet elektroforese onmiddellik na ekstraksie uitgevoer word, en die elektroforesebuffer moet vervang word met 'n nuut voorbereide een.
4. Sout en organiese oplosmiddelreste
Die ekstraksiereagense bevat fenol- en guanidiensoute, en die wasoplossing bevat etanol.Tydens die ekstraksieproses is die lysaat nie heeltemal geabsorbeer en weggegooi nie, en die wasoplossing is nie heeltemal gedroog nie.Residuele soute en organiese oplosmiddels is skadelik vir daaropvolgende omgekeerde transkripsie en PCR.Verskillende grade van inhibisie, dus moet die weefsellisaat ten volle verwyder word tydens die ekstraksieproses, en die wasgoed moet voldoende wees sodat die omliggende mure van die buis gewas kan word.Daarbenewens word die buis leeggemaak en geblaas is 'n noodsaaklike stap, wat die oorblyfsel van organiese materiaal verder sal verminder.
Vir meer inligting oor RNA-ekstraksie, volg asseblief ons webwerf:
www.foreivd.com vir meer inligting.
Postyd: Des-01-2022
