Verskeie revolusionêre uitvindings in die geskiedenis van opsporingstegnologie in my gedagtes is immunolabeling-tegnologie gebaseer op die beginsel van antigeen-teenliggaam-spesifieke binding, PCR-tegnologie en volgordebepalingstegnologie.Vandag sal ons praat oor PCR-tegnologie.Volgens die evolusie van PCR-tegnologie verdeel mense PCR-tegnologie gewoonlik in drie generasies: gewone PCR-tegnologie, intydse fluoresserende kwantitatiewe PCR-tegnologie en digitale PCR-tegnologie.
Common PCR tegniek
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis het die polimerase kettingreaksie (polimerase kettingreaksie, PCR) in 1983 uitgevind. Daar word gesê dat toe hy sy meisie bestuur het, hy skielik 'n flits van inspirasie gehad het en aan die beginsel van PCR (oor die voordele van bestuur) gedink het.Kary Mullis is in 1993 met die Nobelprys in Chemie bekroon. Die New York Times het gesê: “Hoogs oorspronklik en betekenisvol, wat biologie amper verdeel in pre-PCR en post-PCR eras.
Die beginsel van PCR: Onder die katalise van DNA-polimerase word die moederstring-DNA as die sjabloon gebruik, en die spesifieke primer word as die beginpunt van verlenging gebruik, en die dogterstring-DNA wat komplementêr tot die moederstring-sjabloon-DNS word, word in vitro gekopieer deur denaturering, uitgloeiing, verlenging en ander stappe.Dit is 'n DNA-sintese-amplifikasietegnologie in vitro, wat enige teiken-DNS in vitro vinnig en spesifiek kan versterk.
Voordele van gewone PCR
1.Klassieke metode, volledige internasionale en plaaslike standaarde
2.Laer koste van instrumentreagense
3.PCR produkte kan herwin word vir ander molekulêre biologie eksperimente
Aanbevole Foregene PCR-masjien: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Verwante produkte: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Nadele van gewone PCR
1.maklik om te besoedel
2.omslagtige operasie
3.slegs kwalitatiewe ontleding
4.Matige sensitiwiteit
5.Daar is nie-spesifieke versterking, en wanneer die nie-spesifieke band dieselfde grootte as die teikenband is, kan dit nie onderskei word nie
Capillêre elektroforese-gebaseerde PCR
In reaksie op die tekortkominge van gewone PCR, het sommige vervaardigers instrumente bekendgestel wat gebaseer is op die beginsel van kapillêre elektroforese.Die elektroforesestap na PCR-amplifikasie word in die kapillêre voltooi.Die sensitiwiteit is hoër, en die verskil van verskeie basisse kan onderskei word en die versterking kan deur MAERKER bereken word.produk inhoud.Die nadeel is dat die PCR-produk nog oopgemaak en in die instrument geplaas moet word, en daar is steeds 'n groot risiko van kontaminasie.
CapillêreElektroforese
2. Intydse fluoresserende kwantitatiewe PCR (Kwantitatiewe Real-time PCR, qPCR) tegnologieFluorescerende kwantitatiewe PCR, ook genoem Real-Time PCR, is 'n nuwe nukleïensuur kwantitatiewe tegnologie wat ontwikkel is deur PE (Perkin Elmer) in 1995. Die ontwikkelingsgeskiedenis van fluoresserende kwantitatiewe PCR is 'n geskiedenis van siel-roerende stryd van reuse soos ABI, Roche en Bio-Rad.As jy belangstel, kan jy dit gaan kyk.Hierdie tegniek is tans die mees volwasse en algemeen gebruikte semi-kwantitatiewe PCR-tegniek.
Aanbevole qPCR-masjien: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Fluorescerende kleurstofmetode (SYBR Green I):SYBR Green I is die mees algemeen gebruikte DNA-bindende kleurstof vir kwantitatiewe PCR, wat nie-spesifiek aan dubbelstring DNA bind.In die vrye toestand gee SYBR Green swak fluoressensie uit, maar sodra dit aan dubbelstring DNA gebind is, neem die fluoressensie 1000-voudig toe.Daarom is die totale fluoresserende sein wat deur 'n reaksie uitgestuur word eweredig aan die hoeveelheid dubbelstring-DNS wat teenwoordig is en sal toeneem met die toename van geamplifiseerde produk.Aangesien die kleurstof nie-spesifiek aan dubbelstring DNA bind, kan vals positiewe resultate gegenereer word.
Verwante produkte: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Fluorescerende sonde metode (Taqman tegnologie): TydensPCR amplifikasie, 'n spesifieke fluoresserende sonde word op dieselfde tyd as 'n paar primers bygevoeg.Die sonde is 'n lineêre oligonukleotied, met 'n fluoresserende verslaggewergroep en 'n fluoresserende uitdoofgroep onderskeidelik aan beide kante gemerk.Wanneer die sonde ongeskonde is, word die fluoresserende sein wat deur die verslaggewergroep uitgestraal word deur die uitblusgroep geabsorbeer, en die opsporing Daar is geen fluoresserende sein nie;tydens PCR-amplifikasie (in die verlengingstadium), sal die 5'-3' Dicer-aktiwiteit van Taq-ensiem die sonde verteer en afbreek, sodat die verslaggewer fluoresserende groep en die uitdoof fluoresserende groep geskei word, sodat die fluoressensie moniteringsisteem Die fluoressensie sein ontvang kan word, dit wil sê elke keer as 'n DNA ketting die volledige molekulering van die sinkronisasie van die fluorescentie geamplifiseer word, wat die fluorescentie van die fluorescerende ketting opgehoopte word. ulering van fluoresserende seine en die vorming van PCR-produkte.Taqman-sondemetode is die mees gebruikte opsporingsmetode in kliniese opsporing.
Verwante produkte: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Voordele van qPCR
1.Die metode is volwasse en die ondersteunende toerusting en reagense is voltooi
2.Medium koste van reagense
3.maklik om te gebruik
4.Hoë opsporing sensitiwiteit en spesifisiteit
Nadele van qPCR
Die mutasie van die teikengeen lei tot gemiste opsporing.
Die opsporingresultaat van lae-konsentrasie-sjabloon kan nie bepaal word nie.
Daar is 'n groot fout wanneer die standaardkurwe vir kwantitatiewe opsporing gebruik word.
3. Digitale PCR (digitale PCR, dPCR) tegnologie
Digitale PCR is 'n tegniek vir die absolute kwantifisering van nukleïensuurmolekules.In vergelyking met qPCR, kan digitale PCR die aantal DNA/RNA-molekules direk lees, wat die absolute kwantifisering van nukleïensuurmolekules in die beginmonster is.In 1999 het Bert Vogelstein en Kenneth W. Kin-zler die konsep van dPCR formeel voorgestel.
In 2006 was Fluidigm die eerste om 'n kommersiële chip-gebaseerde dPCR-instrument te vervaardig.In 2009 het Life Technologies die OpenArray- en QuantStudio 12K Flex dPCR-stelsels bekendgestel.In 2013 het Life Technologies die QuantStudio 3DdPCR-stelsel bekendgestel, wat hoëdigtheid-nanoskaal mikrofluïdiese skyfietegnologie gebruik om monsters eweredig na 20 000 individuele selle te versprei.in die reaksie goed.
In 2011 het Bio-Rad die druppelgebaseerde QX100 dPCR-instrument bekendgestel, wat water-in-olie-tegnologie gebruik om die monster eweredig na 20 000 druppel-water-in-olie te versprei, en 'n druppelontleder gebruik om die druppels te ontleed.In 2012 het RainDance die RainDrop dPCR-instrument, aangedryf deur hoëdrukgas, bekendgestel om elke standaardreaksiestelsel in 'n reaksie-emulsie te verdeel wat 1 miljoen tot 10 miljoen pikoliter-vlak mikrodruppels bevat.
Tot dusver het digitale PCR twee groot faksies gevorm, skyfietipe en druppeltipe.Maak nie saak watter soort digitale PCR nie, die kernbeginsels daarvan is die beperking van verdunning, eindpunt-PCR en Poisson-verspreiding.Die standaard PCR-reaksiesisteem wat nukleïensuurtemplate bevat, word eweredig verdeel in tienduisende PCR-reaksies, wat na skyfies of mikrodruppels versprei word, sodat elke reaksie soveel as moontlik ’n templaatmolekule bevat, en ’n enkelmolekule-template PCR-reaksie word uitgevoer.Deur die fluoressensie te lees, word die teenwoordigheid of afwesigheid van die sein getel, en die absolute kwantifisering word uitgevoer na kalibrasie van die statistiese Poisson-verspreiding.
Die volgende is die kenmerke van verskeie digitale PCR-platforms wat ek gebruik het:
1. Bio-Rad QX200 druppel digitale PCR Bio-RadQX200 is 'n baie klassieke digitale PCR-platform, die basiese opsporingsproses: 20 000 monsters word gegenereer deur die druppelgenerator Water-in-olie mikrodruppels word op 'n gewone PCR-masjien versterk, en uiteindelik word die fluoressensiesein van elke mikrodruppel deur 'n mikrodruppelleser gelees.Die operasie is meer ingewikkeld, en die risiko van besoedeling is medium.
Xinyi TD1 mikro-druppel digitale PCRXinyi TD1 is 'n huishoudelike digitale PCR-platform, die basiese opsporingsproses: genereer 30,000-50,000 water-in-olie druppels deur 'n druppelgenerator, versterk op 'n algemene PCR-instrument, en slaag uiteindelik Die druppelleser lees die fluoresserende sein van elke druppel.Beide druppelgenerering en lees in hierdie platform word uitgevoer in 'n toegewyde skyfie met 'n lae risiko van kontaminasie.
STILLA Naica mikro-druppel chip digitale PCRSTILLA Naica is 'n relatief nuwe digitale PCR-platform.Die basiese opsporingsproses is: voeg die reaksie-oplossing by die skyfie, plaas die skyfie in die mikrodruppelgenerering en versterkingstelsel, en genereer 30 000 mikrodruppels.Versprei op die skyfie, en PCR-versterking word op die skyfie voltooi.Dan word die versterkte skyfie oorgedra na die mikrodruppelleesanalisestelsel, en die fluoresserende sein word gelees deur foto's te neem.Aangesien die hele proses in 'n geslote skyfie plaasvind, is die risiko van kontaminasie laag.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D chip digitale PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D is nog 'n klassieke chip-gebaseerde digitale PCR-platform.Die basiese opsporingsproses is: voeg die reaksie-oplossing by die strooier, en versprei die reaksie-oplossing eweredig op die skyfie met 20 000 mikroputte deur die strooier., plaas die skyfie op die PCR-masjien om te versterk, en plaas uiteindelik die skyfie in die leser en neem 'n foto om die fluoresserende sein te lees.Die operasie is relatief ingewikkeld, en die hele proses word in 'n geslote skyfie uitgevoer, en die risiko van kontaminasie is laag.
5. JN MEDSYS Clarity chip digitale PCR
JN MEDSYS Clarity is 'n relatief nuwe chip-tipe digitale PCR platform.Die basiese opsporingsproses is: voeg die reaksie-oplossing in die toediener, en versprei die reaksie-oplossing eweredig op 10 000 PCR-buise wat in die PCR-buis vasgemaak is deur die toediener.Op die mikroporeuse skyfie gaan die reaksieoplossing die skyfie binne deur kapillêre werking, en die PCR-buis met die skyfie word op die PCR-masjien geplaas vir versterking, en uiteindelik word die skyfie in die leser geplaas om die fluoresserende sein te lees deur 'n foto te neem.Die operasie is meer ingewikkeld.Die risiko van kontaminasie is laag.
Die parameters van elke digitale PCR-platform word soos volg opgesom:
Die evaluasie-aanwysers van die digitale PKR-platform is: die aantal gesplete eenhede, die aantal fluoresserende kanale, die kompleksiteit van die werking en die risiko van kontaminasie.Maar die belangrikste ding is die opsporing akkuraatheid.Een manier om digitale PCR-platforms te evalueer is om veelvuldige digitale PCR-platforms te gebruik om mekaar te verifieer, en 'n ander manier is om standaardstowwe met akkurate waardes te gebruik.
Voordele van dPCR
1.Die bereiking van absolute kwantifisering
2.Hoër sensitiwiteit en spesifisiteit
3.Kan lae kopie monsters opspoor
Nadele van dPCR1. Duur toerusting en reagense 2. Ingewikkelde werking en lang opsporingstyd 3. Nou opsporingsreeks
Tans het die drie generasies PCR-tegnologie hul eie voordele en nadele, en elkeen het sy eie toepassingsvelde, en dit is nie 'n verhouding dat een generasie die ander vervang nie.Die voortdurende vooruitgang van tegnologie het nuwe vitaliteit in PCR-tegnologie ingespuit, wat dit in staat stel om die een toepassingsrigting na die ander te ontsluit, wat nukleïensuuropsporing geriefliker en akkurater maak.
Bron: Dr. Yuan neem jou vir toetsing
Aanbevole produkte:
Postyd: 18 Nov 2022
