Oorsig
Vinnige identifikasie van transgeniese plante
Teks/Tong Yucheng
Eksperimentele operasie/Han Ying
Redakteur/Wen Youjun
Woorde/1600+
Voorgestelde leestyd/8-10 minute
Vinnige identifikasie van transgeniese plante
As 'n nuweling in die laboratorium is dit nie 'n goeie werk om positiewe plante uit 'n klomp plante met 'n lae omsetkoers uit te sif nie.Eerstens moet DNS een vir een uit 'n groot aantal monsters onttrek word, en dan sal die vreemde gene deur PCR opgespoor word.Die resultate is egter dikwels spasies en bande met 'n paar items af en toe, maar dit is onmoontlik om te bepaal of daar gemiste bespeurings of vals bespeurings is..Is dit baie hulpeloos om sulke eksperimentele proses en resultate in die gesig te staar?Moenie bekommerd wees nie, broer leer jou hoe om transgeniese positiewe plante maklik en akkuraat uit te sif.
Stap 1: Ontwerp deteksie primers
Bepaal die endogene geen en eksogene geen wat opgespoor moet word volgens die monster wat getoets moet word, en kies 'n verteenwoordigende 100-500bp volgorde in die geen vir primer ontwerp.Goeie primers kan die akkuraatheid van die opsporingsresultate verseker en die opsporingstyd verkort (sien die bylaag vir algemeen gebruikte opsporing primers).
Let wel:
Die nuut ontwerpte primers moet die reaksietoestande optimaliseer en die akkuraatheid, akkuraatheid en opsporingslimiet van die opsporing verifieer voordat grootskaalse opsporing uitgevoer word.
Stap 2:Ontwikkel eksperimentele protokol
Positiewe beheer: Gebruik die gesuiwerde DNA wat die teikenfragment bevat as 'n templaat om te bepaal of die PKR-reaksiestelsel en toestande normaal is.
Negatiewe/leë kontrole: Gebruik 'n DNA-sjabloon of ddH2O wat nie die teikenfragment as 'n sjabloon bevat om vas te stel of daar 'n bron van kontaminasie in die PKR-stelsel is nie.
Interne verwysingsbeheer: gebruik die primer/probe-kombinasie van die endogene geen van die monster wat getoets moet word om te evalueer of die templaat deur PCR opgespoor kan word.
Let wel:
Positiewe, negatiewe/blanko kontroles en interne beheerkontroles moet vir elke toets gestel word om die geldigheid van die eksperimentele resultate te evalueer.
Stap 3: Eksperiment voorbereiding
Voor gebruik, kyk of die oplossing eweredig gemeng is.Indien neerslag gevind word, moet dit opgelos en gemeng word volgens die instruksies voor gebruik.2×PCR-mengsel moet gepipetteer en herhaaldelik met 'n mikropipet gemeng word voor gebruik om ongelyke ioonverspreiding te vermy.
Let wel:
Haal die instruksies uit en lees dit noukeurig, en tref voorbereidings voor die eksperiment streng volgens die instruksies.
Stap 4: Berei PCR-reaksiestelsel voor
Volgens die eksperimentele protokol, meng die primers, H2O, 2×PCR meng, sentrifugeer en versprei dit na elke reaksiebuis.
Let wel:
Vir grootskaalse of langtermyntoetsing word dit aanbeveel om 'n PCR-reaksiestelsel te gebruik wat UNG-ensiem bevat, wat aërosolbesmetting wat deur PCR-produkte veroorsaak word, effektief kan vermy.
Stap 5: Voeg reaksiesjabloon by
Deur direkte PCR-tegnologie te gebruik, is daar geen behoefte aan vervelige nukleïensuursuiweringsproses nie.Die monstersjabloon kan binne 10 minute voorberei word en by die ooreenstemmende PCR-reaksiestelsel gevoeg word.
Let wel:
Die Lysis-metode het 'n beter opsporing-effek, en die verkrygde produk kan vir veelvuldige opsporingsreaksies gebruik word.
5.1: Direkte PKR van blare
Volgens die grootte van die prentjie in die handleiding, sny die blaarweefsel met 'n deursnee van 2-3mm en plaas dit in die PCR-reaksiestelsel.
Let wel: Maak seker dat die blaarfragmente heeltemal in die PCR-reaksieoplossing gedompel is, en moenie oormatige blaarweefsel byvoeg nie.
5.2: Blaarlismetode
Sny die blaarweefsel met 'n deursnee van 5-7mm en plaas dit in 'n sentrifugebuis.As jy volwasse blare kies, vermy asseblief die gebruik van die weefsels van die hoofaar van die blaar.Pipetteer 50ul Buffer P1-lisaat in 'n sentrifugebuis om te verseker dat die lysaat die blaarweefsel heeltemal kan onderdompel, plaas dit in 'n termiese siklus of metaalbad, en liseer by 95°C vir 5-10 minute.
Voeg 50 ul Buffer P2 neutralisasie oplossing by en meng goed.Die resulterende lysaat kan as 'n templaat gebruik word en by die PCR-reaksiestelsel gevoeg word.
Let wel: Die hoeveelheid sjabloon moet tussen 5-10% van die PKR-stelsel wees, en moet nie 20% oorskry nie (byvoorbeeld, in 'n 20μl PKR-stelsel, voeg 1-2μl lysisbuffer by, nie meer as 4μl nie).
Stap 6: PCR-reaksie
Nadat die PCR-reaksiebuis gesentrifugeer is, plaas dit in 'n PCR-instrument vir amplifikasie.
Let wel:
Die reaksie gebruik nie-gesuiwerde sjabloon vir amplifikasie, dus is die aantal amplifikasiesiklusse 5-10 meer siklusse as wanneer gesuiwerde DNA-sjabloon gebruik word.
Stap 7: Elektroforese-opsporing en resultaat-analise
M:100bp DNA-leer
1\4: Gesuiwerde DNA-metode
2\5: Direkte PCR-metode
3\6: Leë beheer
Kwaliteitsbeheer:
Die toetsresultate van die verskillende kontroles wat in die eksperiment gestel is, moet aan die volgende voorwaardes voldoen.Andersins moet die oorsaak van die probleem ontleed word, en die toets moet weer uitgevoer word nadat die probleem uitgeskakel is.
Tabel 1. Normale toetsresultate van verskeie kontrolegroepe
*Wanneer die plasmied as 'n positiewe kontrole gebruik word, kan die endogene geentoetsresultaat negatief wees
Uitslag oordeel:
A. Die toetsresultaat van die endogene geen van die monster is negatief, wat aandui dat die DNS wat geskik is vir gewone PKR-opsporing nie uit die monster onttrek kan word nie of die onttrekte DNS bevat PKR-reaksie-inhibeerders, en die DNS moet weer onttrek word.
B. Die toetsresultaat van die endogene geen van die monster is positief, en die toetsresultaat van die eksogene geen is negatief, wat aandui dat die DNS wat geskik is vir gewone PCR-opsporing uit die monster onttrek word, en daar kan geoordeel word dat die XXX-geen nie in die monster opgespoor word nie.
C. Die toetsresultaat van die endogene geen van die monster is positief, en die toetsresultaat van die eksogene geen is positief, wat aandui dat die DNS wat geskik is vir gewone PKR-opsporing uit die monster onttrek is, en die monster DNS bevat die XXX geen.Bevestigingseksperimente kan verder uitgevoer word.
Stap 8: Ontwerp opsporingsprimers
Na die eksperiment, gebruik 2% natriumhipochlorietoplossing en 70% etanoloplossing om die eksperimentele area af te vee om omgewingsbesoedeling te voorkom.
Bylaag
Tabel 2. Algemeen gebruikte primers vir algemene PKR-opsporing van geneties gemodifiseerde plante
Verwysingsdokument:
SN/T 1202-2010, Kwalitatiewe PCR-opsporingsmetode vir geneties gemodifiseerde plantbestanddele in voedsel.
Ministerie van Landbou Aankondiging 1485-5-2010, Toetsing van die bestanddele van geneties gemodifiseerde plante en hul produkte - rys M12 en sy afgeleides.
Postyd: Jun-09-2021
