Geen versterkingseine nie

1.Die Taq DNA Polimerase in die stel verloor sy aktiwiteit as gevolg van onbehoorlike berging of verstryking van die kit.
Aanbeveling: Bevestig die bergingstoestande van die kit;voeg weer 'n toepaslike hoeveelheid Taq DNA Polimerase by die PCR-stelsel of koop 'n nuwe Real Time PCR Kit vir verwante eksperimente.

2.Daar is baie inhibeerders van Taq DNA Polimerase in die DNA-sjabloon.
Voorstel: Hersuiwer die sjabloon of verminder die hoeveelheid sjabloon wat gebruik word.

3. Die Mg2+ konsentrasie is nie geskik nie.
Aanbeveling: Die Mg2+ konsentrasie van die 2× Real PCR Mix wat ons verskaf, is 3.5mM.Vir sommige spesiale primers en templates kan die Mg2+ konsentrasie egter hoër wees.Daarom kan jy MgCl2 direk byvoeg om die Mg2+ konsentrasie te optimaliseer.Dit word aanbeveel om die Mg2+ 0.5mM elke keer te verhoog vir optimalisering.

4. Die PCR amplifikasie toestande is nie geskik nie, en die primer volgorde of konsentrasie is onbehoorlik.
Voorstel: bevestig die korrektheid van die primervolgorde en die primer is nie afgebreek nie;as die versterkingsein nie goed is nie, probeer om die uitgloeitemperatuur te verlaag en pas die primerkonsentrasie gepas aan.

5.Die hoeveelheid sjabloon is te min of te veel.
Aanbeveling: Doen sjabloon linearisering gradiënt verdunning, en kies die sjabloon konsentrasie met die beste PCR effek vir Real Time PCR eksperiment.

NTC het te hoë fluoressensiewaarde

1.Reagensbesoedeling veroorsaak tydens operasie.
Aanbeveling: Vervang met nuwe reagense vir Real Time PCR eksperimente.

2. Kontaminasie het plaasgevind tydens die voorbereiding van die PCR-reaksiesisteem.
Aanbeveling: Tref die nodige beskermende maatreëls tydens operasie, soos: die dra van latexhandskoene, die gebruik van 'n pipetpunt met 'n filter, ens.

3.Die primers word afgebreek, en die degradasie van die primers sal nie-spesifieke amplifikasie veroorsaak.
Voorstel: Gebruik SDS-PAGE elektroforese om vas te stel of die primers afgebreek is, en vervang dit met nuwe primers vir Real Time PCR eksperimente.

Primer dimeer of nie-spesifieke amplifikasie

1. Die Mg2+ konsentrasie is nie geskik nie.
Aanbeveling: Die Mg2+ konsentrasie van die 2× Real PCR EasyTM Mix wat ons verskaf, is 3,5 mM.Vir sommige spesiale primers en templates kan die Mg2+ konsentrasie egter hoër wees.Daarom kan jy MgCl2 direk byvoeg om die Mg2+ konsentrasie te optimaliseer.Dit word aanbeveel om die Mg2+ 0.5mM elke keer te verhoog vir optimalisering.

2.Die PCR-gloeitemperatuur is te laag.
Voorstel: Verhoog die PCR-gloeitemperatuur elke keer met 1 ℃ of 2 ℃.

3.Die PCR-produk is te lank.
Aanbeveling: Die lengte van die Real Time PCR-produk moet tussen 100-150bp wees, nie meer as 500bp nie.

4.Die primers word afgebreek, en die degradasie van die primers sal lei tot die voorkoms van spesifieke amplifikasie.
Voorstel: Gebruik SDS-PAGE elektroforese om vas te stel of die primers afgebreek is, en vervang dit met nuwe primers vir Real Time PCR eksperimente.

5. Die PCR-stelsel is onbehoorlik, of die stelsel is te klein.
Voorstel: Die PCR-reaksiestelsel is te klein, sal veroorsaak dat die opsporing akkuraatheid afneem.Dit is die beste om die reaksiestelsel wat deur die kwantitatiewe PCR-instrument aanbeveel word te gebruik om die Real Time PCR-eksperiment weer uit te voer.

Swak herhaalbaarheid van kwantitatiewe waardes

1. Die instrument funksioneer nie.
Voorstel: Daar kan foute tussen elke PCR-gat van die instrument wees, wat lei tot swak reproduseerbaarheid tydens temperatuurbestuur of opsporing.Kontroleer asseblief volgens die instruksies van die ooreenstemmende instrument.

2.Die monstersuiwerheid is nie goed nie.
Aanbeveling: Onsuiwer monsters sal lei tot swak reproduceerbaarheid van die eksperiment, wat die suiwerheid van die sjabloon en primers insluit.Dit is die beste om die sjabloon te hersuiwer, en die primers word die beste gesuiwer deur SDS-PAGE.

3. Die PKR-stelsel voorbereiding en berging tyd is te lank.
Voorstel: Gebruik die Real Time PCR-stelsel vir PCR-eksperiment onmiddellik na voorbereiding, en moet dit nie te lank eenkant laat nie.

4. Die PCR amplifikasie toestande is nie geskik nie, en die primer volgorde of konsentrasie is onbehoorlik.
Voorstel: bevestig die korrektheid van die primervolgorde en die primer is nie afgebreek nie;as die versterkingsein nie goed is nie, probeer om die uitgloeitemperatuur te verlaag en pas die primerkonsentrasie gepas aan.

5. Die PCR-stelsel is onbehoorlik, of die stelsel is te klein.
Voorstel: Die PCR-reaksiestelsel is te klein, sal veroorsaak dat die opsporing akkuraatheid afneem.Dit is die beste om die reaksiestelsel wat deur die kwantitatiewe PCR-instrument aanbeveel word te gebruik om die Real Time PCR-eksperiment weer uit te voer.