Direkte PCR is 'n reaksie wat dier- of plantweefsels direk gebruik vir amplifikasie sonder nukleïensuurekstraksie.Op baie maniere werk direkte PCR soos gewone PCR

Die belangrikste verskil is die pasgemaakte buffer wat in direkte PKR gebruik word, die monster kan direk aan die PKR-reaksie onderwerp word sonder nukleïensuur-ekstraksie, maar daar is ooreenstemmende vereistes vir die verdraagsaamheid van die ensieme en die verenigbaarheid van die buffer wat by die direkte PKR-reaksie betrokke is.

Alhoewel daar min of meer PCR-inhibeerders in algemene monsters is, kan direkte PCR steeds betroubare amplifikasie bereik onder die werking van ensieme en buffers.Die tradisionele PCR-reaksie vereis nukleïensuur van hoë gehalte as 'n templaat, wat die gladde vordering van PCR-reaksie kan inhibeer as die templaat proteïene en ander onsuiwerhede bevat.Direkte PCR is tans een van die meer gewilde tegnologieë op die gebied van molekulêre diagnostiek.

01 Direkte PCR is oorspronklik vir dier en plant gebruik

Die vroegste toepassing van direkte PKR is in die veld van diere en plante, soos die bloed, weefsel en hare van die rot, kat, hoender, konyn, skape, beeste, ens., plantblare en sade, ens., wat gebruik word om genotipering, transgenies, plasmied-opsporing, Gene-uitklop-analise, DNA-bron-identifikasie en ander spesie-analise-identifikasie, SNP-veldidentifikasie te bestudeer.

Hierdie velde het 'n paar algemene kenmerke, dit wil sê, die teikengeen-inhoud is relatief hoog en nukleïensuur-ekstraksie is lastig, so direkte PCR kan nie net tyd bespaar en 'n klein impak op die resultate hê nie, maar ook koste bespaar.

Direkte PCR wat gebruik word vir die opsporing van patogeen is 'n kwessie van onlangse jare, sommige PCR-reagensvervaardigers het baie pogings in hierdie rigting aangewend wanneer hulle innovasie maak.Veral in hierdie COVID-19-epidemie, het baie sulke opsporingsprodukte op die mark verskyn, soos SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) wat deur Foregene nagevors en ontwikkel is, wat intydse RT PCR-tegnologie (rRT-PCR) gebruik vir kwalitatiewe opsporing van SARS-CoVinge- of swawelsuurmonsters in swawelsuur of swawelsuurmonsters. s.

Foregene is een van die maatskappye wat Direct PCR-tegnologie gebruik vir die opsporing van normale ORF1ab, N, E, envariant afstammingsnukleïensure in menslike nasofaryngeale of orofaringeale deppermonsters soos SARS-CoV-2 B.1.1.7-lyn (VK), B.1.351-lyn (ZA), B.1.617-lyn (IND) en P.1-lyn (BR).

02  Reagense benodig vir direkte PCR

Monster Lysaat

Die monsterlysaat kan self gekonfigureer word of gekoop word.Die verskil in die samestelling van verskillende handelsmerke lysaat sal die lyseringsvermoë anders maak, en dan sal die lyseringstyd effens anders wees.Byvoorbeeld, vir die voorbereiding van diereweefselmonsters, word 30 minute of oornag lise oor die algemeen aanbeveel, en die lise oplossing vir virusse wissel van 3-10 minute.

PCR-meestermengsel

Dit word aanbeveel om warmstart-DNA-polimerase te gebruik om spesifieke amplifikasie te verbeter en die amplifikasievermoë te verhoog.Die kern van direkte PCR is 'n hoogs verdraagsame polimerase.

Elimineer of inhibeer komponente in die monster wat DNA-amplifikasie beïnvloed

Nadat die monster met die lysaat verwerk is, sal proteïene, lipiede en ander selafval vrygestel word, hierdie stowwe sal die PCR-reaksie inhibeer.Daarom vereis direkte PKR die byvoeging van ooreenstemmende verwydering of inhibeerders om die invloed van hierdie faktore te verminder.

03  'n Versameling van vyf kennispunte van direkte PKR

Eerstens, Direct PCR-tegnologie is 'n direkte PCR-tegnologie vir verskeie biologiese monsters.Onder hierdie tegniese toestand is dit nie nodig om die nukleïensuur te skei en te onttrek nie, die weefselmonster direk as die voorwerp te gebruik en die teikengeen-inleiders by te voeg om die PCR-reaksie uit te voer.

Tweedens, Direkte PCR-tegnologie is nie net 'n tradisionele DNA-sjabloonversterkingstegnologie nie, maar sluit ook RNA-sjabloon omgekeerde transkripsie-PKR in.

Derdens voer Direct PCR-tegnologie nie net roetine kwalitatiewe PCR-reaksies direk op weefselmonsters uit nie, maar sluit ook Real-Time qPCR-reaksies in, wat vereis dat die reaksiestelsel sterk anti-agtergrond-fluoressensie-interferensievermoë het en endogene fluoressensie blus die antagonistiese vermoë.

Vierdens, die monsters wat deur die Direkte PCR-tegnologie geteiken word, benodig slegs die vrystelling van nukleïensuursjablone, en verwyder nie proteïene, polisakkariede, souione, ens. wat met die PCR-reaksie inmeng nie.Wat vereis dat die nukleïensuurpolimerase en PCR-mengsel in die reaksiestelsel uitstekende weerstand en aanpasbaarheid het om ensiemaktiwiteit en replikasie-akkuraatheid onder komplekse toestande te verseker.

Vyfdens, die weefselmonster wat deur Direct PCR-tegnologie geteiken word sonder enige nukleïensuurverrykingsbehandeling en die hoeveelheid sjabloon is baie klein, wat vereis dat die reaksiestelsel uiters hoë sensitiwiteit en amplifikasiedoeltreffendheid moet hê.