一、Verhoog die sensitiwiteit van die reaksiestelsel：

1. Isoleer hoë kwaliteit RNA:

Suksesvolle cDNA-sintese kom van hoë-gehalte RNA.RNS van hoë gehalte moet ten minste volle lengte wees en vry van omgekeerde transkripsie-inhibeerders soos EDTA of SDS.Die kwaliteit van RNA bepaal die maksimum hoeveelheid volgorde-inligting wat jy in cDNA kan transkribeer.'n Algemene RNA-suiweringsmetode is 'n eenstap-metode wat guanidien isotiosianaat/suurfenol gebruik.Om kontaminasie deur spoorhoeveelhede RNase te voorkom, moet RNA wat uit RNase-ryke monsters (soos pankreas) geïsoleer is, in formaldehied gestoor word om RNA van hoë gehalte te bewaar, veral vir langtermynberging.Die RNA wat uit rotlewer onttrek is, is basies afgebreek nadat dit vir een week in water gestoor is, terwyl die RNA wat uit rotmilt onttrek is, stabiel gebly het nadat dit vir 3 jaar in water gestoor is.Daarbenewens is transkripsies langer as 4 kb meer sensitief vir degradasie deur spoor RNases as klein transkripsies.Om die stabiliteit van gestoorde RNA-monsters te verhoog, kan RNA in gedeïoniseerde formamied opgelos en by -70°C gestoor word.Formamied wat gebruik word om RNA te bewaar, moet vry wees van RNA-afbrekende puin.RNA van pankreas kan vir ten minste een jaar in formamied bewaar word.Wanneer jy voorberei om RNA te gebruik, kan jy die volgende metode gebruik om RNA te presipiteer: voeg NaCl by 0.2M en 4 keer die volume etanol, plaas by kamertemperatuur vir 3-5 minute en sentrifugeer by 10 000×g vir 5 minute.

2. Gebruik die RNaseH-onaktiewe (RNaseH-) omgekeerde transkriptase:

RNase-inhibeerders word dikwels by omgekeerde transkripsie-reaksies gevoeg om die lengte en opbrengs van cDNA-sintese te verhoog.RNase-inhibeerders moet bygevoeg word tydens die eerste-string sintesereaksie in die teenwoordigheid van 'n buffer en 'n reduseermiddel (soos DTT), omdat die proses voor cDNA sintese die inhibeerder denatureer, en sodoende gebonde RNase vrystel wat RNA kan afbreek.Proteïen-RNase-inhibeerders verhoed slegs die afbraak van RNA deur RNase A, B, C, en verhoed nie RNase op die vel nie, dus wees versigtig om nie RNase van jou vingers af in te voer ten spyte van die gebruik van hierdie inhibeerders nie.

Omgekeerde transkriptase kataliseer die omskakeling van RNA na cDNA.Beide M-MLV en AMV het endogene RNaseH-aktiwiteit bykomend tot hul eie polimerase-aktiwiteit.RNaseH-aktiwiteit en polimerase-aktiwiteit kompeteer met mekaar vir die hibriede string wat tussen die RNA-sjabloon en die DNA-primer of cDNA-verlengstring gevorm word, en degradeer die RNA-string in die RNA:DNA-kompleks.Die RNA-sjabloon wat deur RNaseH-aktiwiteit afgebreek word, kan nie meer as 'n effektiewe substraat vir cDNA-sintese dien nie, wat die opbrengs en lengte van cDNA-sintese verminder.Daarom sal dit voordelig wees om die RNaseH-aktiwiteit van omgekeerde transkriptase uit te skakel of aansienlik te verminder.

SuperScript Ⅱ omgekeerde transkriptase, RNaseH-MMLV trutranskriptase en termoSkript omgekeerde transkriptase, RNaseH-AMV, kan meer hoeveelheid en meer vollengte cDNA verkry as MMLV en AMV.RT-PKR sensitiwiteit sal beïnvloed word deur die hoeveelheid cDNA sintese.ThermoScript is baie meer sensitief as AMV.Die grootte van RT-PCR produkte word beperk deur die vermoë van omgekeerde transkriptase om cDNA te sintetiseer, veral wanneer groter cDNA's gekloon word.In vergelyking met MMLV, het SuperScripⅡ die opbrengs van lang RT-PCR produkte aansienlik verhoog.Die RNaseH-omgekeerde transkriptase het ook verhoogde termostabiliteit, dus kan die reaksie uitgevoer word by temperature hoër as die normale 37-42°C.Onder die voorgestelde sintese toestande, gebruik oligo(dT) primer en 10 μCi van [α-P]dCTP.Die totale opbrengs van eerste string is bereken deur gebruik te maak van die TCA-presipitasiemetode.Vollengte cDNA is ontleed deur gebruik te maak van grootte-gesorteerde bande wat uitgesny is en op 'n alkaliese agarose gel getel is.

3. Verhoog die inkubasietemperatuur vir omgekeerde transkripsie:

'n Hoër inkubasietemperatuur help om die RNA se sekondêre struktuur oop te maak, wat die opbrengs van die reaksie verhoog.Vir die meeste RNA-sjablone sal die inkubasie van die RNA en primers by 65°C sonder buffer of sout, gevolg deur vinnige afkoeling op ys, die meeste sekondêre strukture uitskakel en primers laat bind.Sommige sjablone het egter steeds sekondêre strukture, selfs na hitte-denaturering.Amplifikasie van hierdie moeilike sjablone kan uitgevoer word met behulp van ThermoScript Reverse Transcriptase en die plasing van die omgekeerde transkripsie reaksie by 'n hoër temperatuur om amplifikasie te verbeter.Hoër inkubasietemperature kan ook spesifisiteit verhoog, veral wanneer geenspesifieke primers (GSP) vir cDNA-sintese gebruik word (sien Hoofstuk 3).Indien GSP gebruik word, maak seker dat die Tm van die primers dieselfde is as die verwagte inkubasietemperatuur.Moenie oligo(dT) en ewekansige primers bo 60°C gebruik nie.Willekeurige primers vereis inkubasie by 25°C vir 10 minute voordat dit verhoog word tot 60°C.Benewens die gebruik van 'n hoër omgekeerde transkripsie temperatuur, kan spesifisiteit ook verbeter word deur die RNA/primer mengsel direk oor te dra vanaf die 65°C denaturasie temperatuur na die omgekeerde transkripsie inkubasie temperatuur en die byvoeging van 'n voorafverwarmde 2× reaksie mengsel (cDNA warmbegin sintese).Hierdie benadering help om die intermolekulêre basisparing te voorkom wat by laer temperature plaasvind.Die veelvuldige temperatuurwisseling wat benodig word vir RT-PCR kan vereenvoudig word deur 'n termiese siklus te gebruik.

Die termostabiele polimerase tree op as 'n DNA-polimerase in die teenwoordigheid van Mg2+ en as 'n RNA-polimerase in die teenwoordigheid van Mn2+.Dit kan warm gehou word teen 'n maksimum temperatuur van 65°C.Die teenwoordigheid van Mn2+ tydens PCR verminder egter getrouheid, wat Tth-polimerase minder geskik maak vir hoë-presisie amplifikasie, soos kloning van cDNA.Daarbenewens het Tth lae omgekeerde transkripsie-doeltreffendheid, wat sensitiwiteit verminder, en aangesien omgekeerde transkripsie en PCR met 'n enkele ensiem uitgevoer kan word, kan kontrolereaksies sonder omgekeerde transkripsie nie gebruik word om cDNA-amplifikasieprodukte met kontaminerende genomiese DNA te vergelyk nie.Die amplifikasieprodukte is geskei.

4. Bymiddels wat omgekeerde transkripsie bevorder:

Bymiddels insluitend gliserol en DMSO word by die eerste-string sintesereaksie gevoeg, wat die stabiliteit van die nukleïensuur dubbelstring kan verminder en die sekondêre struktuur van RNA kan losmaak.Tot 20% gliserol of 10% DMSO kan bygevoeg word sonder om SuperScript II- of MMLV-aktiwiteit te beïnvloed.AMV kan ook tot 20% gliserol verdra sonder verlies aan aktiwiteit.Ten einde die sensitiwiteit van RT-PCR in die SuperScriptⅡ omgekeerde transkripsie reaksie te maksimeer, kan 10% gliserol bygevoeg en by 45°C geïnkubeer word.As 1/10 van die omgekeerde transkripsie-reaksieproduk by PCR gevoeg word, dan is die konsentrasie gliserol in die amplifikasiereaksie 0,4%, wat nie genoeg is om PCR te inhibeer nie.

5. RNaseH behandel:

Behandeling van cDNA sintesereaksies met RNaseH voor PCR kan sensitiwiteit verhoog.Vir sommige sjablone word daar gedink dat RNA in die cDNA-sintesereaksie die binding van amplifikasieprodukte voorkom, in welke geval RNaseH-behandeling sensitiwiteit kan verhoog.Oor die algemeen is RNaseH-behandeling nodig wanneer langer vollengte cDNA-teikensjablone geamplifiseer word, soos lae-kopie tuberous scherosis II.Vir hierdie moeilike sjabloon het RNaseH-behandeling die sein wat deur SuperScript II of AMV-gesintetiseerde cDNA geproduseer word, verbeter.Vir die meeste RT-PKR-reaksies is RNaseH-behandeling opsioneel, want die PCR-denaturasiestap by 95°C hidroliseer gewoonlik die RNA in die RNA:DNA-kompleks.

6. Verbetering van klein RNA-opsporingsmetode:

RT-PKR is veral uitdagend wanneer slegs klein hoeveelhede RNA beskikbaar is.Glikogeen wat as 'n draer tydens RNA-isolasie bygevoeg word, help om die opbrengs van klein monsters te verhoog.RNase-vrye glikogeen kan op dieselfde tyd as Trizol bygevoeg word.Glikogeen is wateroplosbaar en kan in die waterfase met RNA gehou word om daaropvolgende presipitasie te help.Vir monsters van minder as 50 mg weefsel of 106 gekweekte selle is die aanbevole konsentrasie RNase-vrye glikogeen 250 μg/ml.

Die byvoeging van geasetyleerde BSA by die omgekeerde transkripsie reaksie met behulp van SuperScript II kan die sensitiwiteit verhoog, en vir klein hoeveelhede RNA kan die vermindering van die hoeveelheid SuperScript II en die byvoeging van 40 eenhede RNaseOut nuklease inhibeerder die vlak van opsporing verhoog.Indien glikogeen in die RNA isolasie proses gebruik word, word dit steeds aanbeveel om BSA of RNase inhibeerder by te voeg wanneer SuperScript II vir omgekeerde transkripsie reaksie gebruik word.

二、Verhoog RT-PCR-spesifisiteit

1. CND-asintese:

Eerste-string cDNA sintese kan geïnisieer word deur gebruik te maak van drie verskillende metodes, waarvan die relatiewe spesifisiteit die hoeveelheid en tipe cDNA wat gesintetiseer word, beïnvloed.

Die ewekansige primer-metode was die minste spesifiek van die drie metodes.Primers gloei op verskeie plekke regdeur die transkripsie, wat kort, gedeeltelike-lengte cDNA's genereer.Hierdie metode word gereeld gebruik om 5'-eindvolgordes te verkry en om cDNA van RNA-sjablone te verkry met streke van sekondêre struktuur of met terminasieplekke wat nie deur tru-transkripsie gerepliseer kan word nie.Om die langste cDNA te verkry, moet die verhouding van primers tot RNA in elke RNA-monster empiries bepaal word.Die beginkonsentrasie van ewekansige primers het gewissel van 50 tot 250 ng per 20 μl reaksie.Aangesien cDNA gesintetiseer vanaf totale RNA met behulp van ewekansige primers hoofsaaklik ribosomale RNA is, word poli(A)+RNA oor die algemeen as die templaat gekies.

Oligo(dT) primers is meer spesifiek as ewekansige primers.Dit hibridiseer met die poli(A) stert wat aan die 3'-punt van die meeste eukariotiese mRNA's gevind word.Omdat poli(A)+ RNA ongeveer 1% tot 2% van totale RNA is, is die hoeveelheid en kompleksiteit van cDNA baie minder as met ewekansige primers.As gevolg van sy hoë spesifisiteit, vereis oligo(dT) oor die algemeen nie optimalisering van die verhouding van RNA tot primers en poli(A)+ seleksie nie.Dit word aanbeveel om 0.5μg oligo(dT) per 20μl reaksiestelsel te gebruik.oligo(dT)12-18 is geskik vir die meeste RT-PCR.Die ThermoScript RT-PCR-stelsel bied oligo(dT)20 vanweë sy beter termiese stabiliteit vir hoër inkubasietemperature.

Geen spesifieke primers (GSP) is die mees spesifieke primers vir die omgekeerde transkripsiestap.GSP is 'n antisense-oligonukleotied wat spesifiek met die RNA-teikenvolgorde kan hibridiseer, anders as ewekansige primers of oligo(dT), wat aan alle RNA's gloei.Dieselfde reëls wat gebruik word om PCR-primers te ontwerp, geld vir die ontwerp van GSP in omgekeerde transkripsie-reaksies.Die GSP kan dieselfde volgorde wees as die amplifikasie-primer wat aan die 3'-kant van die mRNA gloei, of die GSP kan ontwerp word om stroomaf van die omgekeerde amplifikasie-primer te analiseer.Vir sommige geamplifiseerde proefpersone moet meer as een antisense primer ontwerp word vir suksesvolle RT-PCR omdat die sekondêre struktuur van die teiken RNA primer binding kan voorkom.Dit word aanbeveel om 1 pmol antisense GSP in 'n 20 μl eerste-string sintesereaksie te gebruik.

2. Verhoog die inkubasietemperatuur vir omgekeerde transkripsie:

Om die volle voordeel van GSP-spesifisiteit te benut, moet 'n omgekeerde transkripsie met hoër termostabiliteit gebruik word.Termostabiele omgekeerde transkriptases kan by hoër temperature geïnkubeer word om reaksiestringensie te verhoog.Byvoorbeeld, as 'n GSP by 55°C uitgloei, sal die spesifisiteit van die GSP nie ten volle benut word as AMV of M-MLV gebruik word vir omgekeerde transkripsie teen 'n lae stringentheid van 37°C nie.SuperScript II en ThermoScript kan egter by 50°C of hoër gereageer word, wat nie-spesifieke produkte wat by laer temperature gegenereer word, sal uitskakel.Vir maksimum spesifisiteit kan die RNA/primermengsel direk vanaf die 65°C denaturasietemperatuur na die omgekeerde transkripsie-inkubasietemperatuur oorgedra word en by 'n voorafverwarmde 2x-reaksiemengsel (cDNA-sintese-warmbegin) gevoeg word.Dit help om intermolekulêre basisparing by lae temperature te voorkom.Die veelvuldige temperatuuroorgange wat benodig word vir RT-PCR kan vereenvoudig word deur 'n termiese siklus te gebruik.

3. Verminder genomiese DNA-besmetting:

'n Potensiële probleem wat met RT-PCR ondervind word, is die kontaminasie van genomiese DNA in die RNA.Die gebruik van 'n goeie RNA-isolasiemetode, soos Trizol Reagens, sal die hoeveelheid genomiese DNA wat die RNA-preparaat besoedel, verminder.Om produkte afkomstig van genomiese DNA te vermy, kan RNA behandel word met amplifikasiegraad DNase I om kontaminerende DNA te verwyder voor omgekeerde transkripsie.Die DNase I-vertering is beëindig deur die monsters in 2.0 mM EDTA vir 10 minute by 65°C te inkubeer.EDTA kan magnesiumione chelaat, wat magnesiumioonafhanklike RNA-hidrolise by hoë temperature voorkom.

Ten einde geamplifiseerde cDNA te skei van kontaminerende genomiese DNA-amplifikasieprodukte, kan primers ontwerp word wat elkeen uitgloei om te skei eksons.PCR-produkte afkomstig van cDNA sal korter wees as dié afkomstig van gekontamineerde genomiese DNA.Daarbenewens is 'n kontrole-eksperiment sonder omgekeerde transkripsie op elke RNA-sjabloon uitgevoer om te bepaal of 'n gegewe fragment van genomiese DNA of cDNA afgelei is.Die PCR-produk wat sonder omgekeerde transkripsie verkry word, is afkomstig van die genoom.