1. Basiese kennis (as jy die eksperimentele deel wil sien, dra asseblief direk oor na die tweede deel)
As 'n afgeleide reaksie van konvensionele PKR monitor Intydse PKR hoofsaaklik die verandering van die hoeveelheid amplifikasieproduk in elke siklus van die PKR-amplifikasiereaksie in reële tyd deur die verandering van die fluoressensiesein, en analiseer die beginsjabloon kwantitatief deur die verhouding tussen die ct-waarde en die standaardkurwe.
Die spesifieke data van RT-PCR isbasislyn, fluoressensie drempelenCt waarde.
| basislyn: | Die fluoressensiewaarde van die 3de-15de siklus is die basislyn (basislyn), wat deur die af en toe fout van die meting veroorsaak word. |
| Drempel (drempel): | Verwys na die fluoressensie-opsporingslimiet wat op 'n toepaslike posisie in die eksponensiële groeigebied van die amplifikasiekurwe gestel is, gewoonlik 10 keer die standaardafwyking van die basislyn. |
| CT waarde: | Dit is die aantal PCR-siklusse wanneer die fluoressensiewaarde in elke reaksiebuis die drempel bereik. Die Ct-waarde is omgekeerd eweredig aan die hoeveelheid aanvanklike sjabloon. |
Algemene etiketteringmetodes vir RT-PCR:
| metode | voordeel | tekortkoming | omvang van toepassing |
| SYBR GroenⅠ | Wye toepaslikheid, sensitief, goedkoop en gerieflik | Primer vereistes is hoog, geneig tot nie-spesifieke bande | Dit is geskik vir kwantitatiewe ontleding van verskeie teikengene, navorsing oor geenuitdrukking en navorsing oor transgeniese rekombinante diere en plante. |
| TaqMan | Goeie spesifisiteit en hoë herhaalbaarheid | Die prys is hoog en slegs geskik vir spesifieke doelwitte. | Patogeenopsporing, geneesmiddelweerstandgeennavorsing, geneesmiddeldoeltreffendheidbepaling, diagnose van genetiese siektes. |
| molekulêre baken | Hoë spesifisiteit, fluoressensie, lae agtergrond | Die prys is hoog, dit is net geskik vir 'n spesifieke doel, die ontwerp is moeilik, en die prys is hoog. | Spesifieke geenanalise, SNP-analise |
2. Eksperimentele stappe
2.1 Oor die eksperimentele groepering- daar moet veelvuldige putte in die groep wees, en daar moet biologiese herhalings wees.
| ① | Leë beheer | Word gebruik om selgroeistatus in eksperimente op te spoor |
| ② | Negatiewe beheer siRNA (nie-spesifieke siRNA volgorde) | Demonstreer die spesifisiteit van RNAi-aksie.siRNA kan nie-spesifieke stresreaksie by 'n konsentrasie van 200nM veroorsaak. |
| ③ | Transfeksie-reagensbeheer | Sluit die toksisiteit van die transfekteringsreagens na die selle of die effek op die uitdrukking van die teikengeen uit |
| ④ | siRNA teen teikengeen | Slaan die uitdrukking van die teikengeen af |
| ⑤ (opsioneel) | positiewe siRNA | Word gebruik om eksperimentele stelsel- en operasionele probleme op te los |
| ⑥ (opsioneel) | Fluorescerende beheer siRNA | Die doeltreffendheid van seltransfeksie kan met 'n mikroskoop waargeneem word |
2.2 Beginsels van onderlaagontwerp
| Versterkte fragmentgrootte | Verkieslik by 100-150bp |
| Primer Lengte | 18-25 bp |
| GC inhoud | 30%-70%, verkieslik 45%-55% |
| Tm waarde | 58-60 ℃ |
| Volgorde | Vermy T/C deurlopend;A/G deurlopend |
| 3 eindvolgorde | Vermy GC ryk of AT ryk;die terminale basis is verkieslik G of C;dit is die beste om T te vermy |
| Komplementariteit | Vermy komplementêre reekse van meer as 3 basisse binne die primer of tussen twee primers |
| Spesifisiteit | Gebruik ontploffingssoektog om primer-spesifisiteit te bevestig |
①SiRNA is spesie-spesifiek, en die volgorde van verskillende spesies sal anders wees.
②SiRNA is verpak in gevriesdroogde poeier, wat stabiel vir 2-4 weke by kamertemperatuur gestoor kan word.
2.3 Gereedskap of reagense wat vooraf voorberei moet word
| Primer (interne verwysing) | Insluitend vorentoe en agtertoe twee |
| Primers (teikengeen) | Insluitend vorentoe en agtertoe twee |
| Teiken Si RNA (3 stroke) | Oor die algemeen sal die maatskappy 3 stroke sintetiseer, en dan een van die drie kies deur RT-PCR |
| Transfeksie Kit | Lipo2000 ens. |
| RNA vinnige ekstraksiestel | Vir RNA-ekstraksie na transfeksie |
| Vinnige omgekeerde transkripsiestel | vir cDNA-sintese |
| PCR Amplification Kit | 2×Super SYBR Groen qPCR Master Mix |
2.4 Met betrekking tot die kwessies waaraan aandag gegee moet word in die spesifieke eksperimentele stappe:
①siRNA transfeksie proses
1. Vir platering kan jy 24-put plaat, 12-put plaat of 6-put plaat kies (die gemiddelde RNA-konsentrasie wat in elke put van 'n 24-put plaat voorgestel word is ongeveer 100-300 ng/uL), en die optimale transfeksiedigtheid van selle is tot 60 % -80% of so
2. Die transfektasiestappe en spesifieke vereistes is streng in ooreenstemming met die instruksies.
3. Na transfektasie kan monsters binne 24-72 uur versamel word vir mRNA-opsporing (RT-PCR) of proteïenopsporing binne 48-96 uur (WB)
② RNA ekstraksie proses
1. Voorkom kontaminasie deur eksogene ensieme.Dit sluit hoofsaaklik die dra van maskers en handskoene in;gebruik van gesteriliseerde pipetpunte en EP-buise;die water wat in die eksperiment gebruik word, moet RNase-vry wees.
2. Dit word aanbeveel om twee keer te doen soos voorgestel in die vinnige ekstraksiestel, wat die suiwerheid en opbrengs werklik sal verbeter.
3. Die afvalvloeistof mag nie aan die RNA-kolom raak nie.
③ RNA kwantifisering
Nadat die RNA onttrek is, kan dit direk met Nanodrop gekwantifiseer word, en die minimum lesing kan so laag as 10ng/ul wees.
④ Omgekeerde transkripsieproses
1. As gevolg van die hoë sensitiwiteit van RT-qPCR, moet ten minste 3 parallelle putte vir elke monster gemaak word om te verhoed dat die daaropvolgende Ct te verskillend is of die SD te groot is vir statistiese analise.
2. Moenie Meestermengsel herhaaldelik vries en ontdooi nie.
3. Elke buis/gat moet met 'n nuwe punt vervang word!Moenie voortdurend dieselfde pipetpunt gebruik om monsters by te voeg nie!
4. Die film wat aan die 96-put plaat geheg is nadat die monster bygevoeg is, moet glad gemaak word met 'n plaat.Dit is die beste om te sentrifugeer voordat dit op die masjien geplaas word, sodat die vloeistof op die buiswand af kan vloei en lugborrels kan verwyder.
⑤ Algemene kurwe-analise
| Geen tydperk van logaritmiese groei nie | Moontlik hoë konsentrasie van sjabloon |
| Geen CT-waarde nie | Verkeerde stappe vir die opsporing van fluoresserende seine; degradasie van primers of probes – die integriteit daarvan kan deur PAGE-elektroforese opgespoor word; onvoldoende hoeveelheid sjabloon; agteruitgang van sjablone – vermy die inbring van onsuiwerhede en herhaalde bevriesing en ontdooiing in monstervoorbereiding; |
| Ct>38 | Lae versterkingsdoeltreffendheid;PCR-produk is te lank;verskeie reaksiekomponente word afgebreek |
| Lineêre versterkingskromme | Probes kan gedeeltelik afgebreek word deur herhaalde vries-ontdooi-siklusse of langdurige blootstelling aan lig |
| Die verskil in duplikaatgate is besonder groot | Die reaksie-oplossing is nie heeltemal gesmelt nie of die reaksie-oplossing is nie gemeng nie;die termiese bad van die PCR-instrument is besmet deur fluoresserende stowwe |
2.5 Oor data-analise
Die data-analise van qPCR kan verdeel word in relatiewe kwantifisering en absolute kwantifisering.Byvoorbeeld, selle in die behandelingsgroep in vergelyking met selle in die kontrolegroep,
Hoeveel keer die mRNA van die X-geen verander, dit is relatiewe kwantifisering;in 'n sekere aantal selle, die mRNA van die X-geen
Hoeveel kopieë daar is, dit is absolute kwantifisering.Wat ons gewoonlik die meeste in die laboratorium gebruik, is die relatiewe kwantitatiewe metode.Gewoonlik,die 2-ΔΔct metodeword die meeste in eksperimente gebruik, dus sal slegs hierdie metode hier in detail bekendgestel word.
2-ΔΔct metode: Die resultaat wat verkry word, is die verskil in die uitdrukking van die teikengeen in die eksperimentele groep relatief tot die teikengeen in die kontrolegroep.Dit word vereis dat die amplifikasie-doeltreffendheid van beide die teikengeen en die interne verwysingsgeen naby aan 100% is, en die relatiewe afwyking moet nie 5% oorskry nie.
Die berekeningsmetode is soos volg:
Δct kontrolegroep = ct-waarde van teikengeen in kontrolegroep – ct-waarde van interne verwysingsgeen in kontrolegroep
Δct eksperimentele groep = ct-waarde van die teikengeen in die eksperimentele groep – ct-waarde van die interne verwysingsgeen in die eksperimentele groep
ΔΔct=Δct eksperimentele groep-Δct kontrolegroep
Laastens, bereken die veelvoud van verskil in uitdrukkingsvlak:
Verander vou=2-ΔΔct (wat ooreenstem met die Excel-funksie is POWER)
Verwante Produkte:
Postyd: 20 Mei 2023
