In die vroeë stadium van die uitbraak, as gevolg van die vinnige ontwikkeling, is vinnige diagnose van vermeende pasiënte die sleutel tot die voorkoming van COVID-19.Sommige goedgekeurde nukleïensuuropsporingsreagense het 'n kort ontwikkelingstyd, en daar is probleme soos oorhaastige prestasiebevestiging, onvoldoende reagensoptimalisering en groot verskille tussen groepe;Die probleme van verskeie kliniese laboratoriums in verskeie aspekte van die nukleïensuuropsporingsproses kan ook die akkuraatheid van nukleïensuuropsporingsresultate beïnvloed.Hierdie artikel sal fokus op die sleutelskakels en punte in die huidige SARS-CoV-2-nukleïensuuropsporing, en die probleme van vals negatiewe en positiewe herondersoek van laboratoriumnukleïensuuropsporing en kliniese inkonsekwentheid ontleed.

Beginsels van SARS-CoV-2 nukleïensuur opsporing

SARS-CoV-2 is 'n RNA-virus met 'n genoomvolgorde van ongeveer 29 kb, met 10 gene, wat effektief vir 10 proteïene kan kodeer.Virusse bestaan ​​uit RNA en proteïene, en die buitenste laag is 'n buitenste laag wat uit lipiede en glikoproteïene bestaan.Binne-in vou die proteïenkapsied die RNA daarin toe en beskerm daardeur die maklik afbreekbare RNA (P1).

P1 Struktuur van SARS-COV-2

Virusse dring selle binne deur spesifieke seloppervlakreseptore om infeksie te veroorsaak, en gebruik gasheerselle om te repliseer.

Die beginsel van virale nukleïensuuropsporing is om die virale RNA deur 'n sellysaat bloot te stel, en dan intydse fluoresserende omgekeerde transkripsie-polimerase kettingreaksie (RT-PCR) vir opsporing te gebruik.

Die sleutel tot die opsporingsbeginsel is om primers en probes te gebruik om "geteikende passing" van nukleïensuurvolgordes te bereik, dit wil sê om die nukleïensuurvolgorde van SARS-CoV-2 te vind wat verskil van ander virusse in ongeveer 30,000 basisse (die ooreenkoms van nukleïensuur met ander virusse) "Lae" area), ontwerp primers en probes.

Die primers en probes is hoogs ooreenstem met die spesifieke streek van SARS-CoV-2 nukleïensuur, dit wil sê, die spesifisiteit is baie sterk.Sodra die intydse fluoresserende RT-PCR-amplifikasieresultaat van die monster wat getoets moet word positief is, bewys dit dat SARS-CoV-2 in die monster teenwoordig is.Sien P2.

P2 Stappe van SARS-CoV-2 nukleïensuurbepaling (intydse fluoresserende RT-PCR)

Voorwaardes en vereistes van laboratorium vir SARS-CoV-2 nukleïensuur opsporing

Nukleïensuurtoetslaboratoriums is die ideaalste vir omgewings met negatiewe druk, en hulle moet aandag gee aan drukmonitering, lug laat vloei en aërosols uitskakel.Nukleïensuurtoetspersoneel moet oor ooreenstemmende kwalifikasies beskik, relevante polimerasekettingreaksie-opleiding ontvang en die assessering slaag.Die laboratorium moet streng bestuur word, in plek gesoneer word, en irrelevante personeel word streng verbied om binne te gaan.Die skoon area moet geventileer en in plek ontsmet word.Relevante items word in sones geplaas, skoon en vuil word geskei, betyds vervang en in plek gedekontamineer.Roetine-ontsmetting: Chloorbevattende ontsmettingsmiddel is die hoofoplossing vir groter areas, en 75% alkohol kan vir klein areas gebruik word.’n Goeie manier om aërosols te hanteer, is om vensters oop te maak vir ventilasie, en lugontsmetting kan ook deur middel van ultravioletstrale, filtrasie en lugontsmetting uitgevoer word.

Sleutelskakels en parameters van SARS-CoV-2 nukleïensuurbepaling (intydse fluoresserende RT-PCR)

Alhoewel laboratoriums oor die algemeen baie aandag gee aan nukleïensuur-“opsporing”, is nukleïensuur-“ekstraksie” trouens ook een van die sleutelstappe vir suksesvolle opsporing, wat nou verband hou met die versameling en berging van virusmonsters.

Tans gebruik die mees gebruikte respiratoriese monsters, soos nasofaryngeale deppers, die tweede metode, wat 'n inaktiveringsoplossing (preservering) is wat op grond van nukleïensuurekstraksie en lisisoplossing voorberei is.Aan die een kant kan hierdie virusbewaringsoplossing die proteïen van die virus denatureer, sy aktiwiteit verloor en nie meer aansteeklik wees nie, en die veiligheid van die vervoer- en opsporingstadium verbeter;aan die ander kant kan dit die virus direk kraak om die nukleïensuur vry te stel, die nukleïensuur-ontbindende ensiem uit te skakel en die virus te voorkom.Die RNA word afgebreek.

'n Virusmonsteroplossing wat op die basis van nukleïensuurekstraksie-lise-oplossing voorberei is.Die hoofkomponente is gebalanseerde soute, etileendiamientetra-asynsuur chelaatvormende middel, guanidien sout (guanidien isotiosianaat, guanidien hidrochloried, ens.), anioniese oppervlakaktiewe middel (dodekaan) natriumsulfaat), kationiese oppervlakaktiewe middel (tetradecyl trimetiel ammonium oksalaat), ditothiokinoline en ander proteïen hidroksiinoline komponente, K-hidroksi- en 8-proteïen, 8-proteïen.Tans is daar baie soorte nukleïensuur-ekstraksiestelle, en verskillende nukleïensuur-ekstraksie- en suiweringsreagense word gebruik.Selfs al word dieselfde nukleïensuur-ekstraksie- en suiweringsreagens gebruik, is die ekstraksieprosedures van elke kit anders.

Tans word die nukleïensuur-opsporingsstelprodukte wat deur die Nasionale Mediese Produkte-administrasie goedgekeur is, gekies op grond van die ORF1ab-, E- en N-gene in die SARS-CoV-2-genoom.Die opsporingsbeginsels van verskillende produkte is basies dieselfde, maar hul primers en probe-ontwerpe verskil.Daar is enkelteikensegmente (ORF1ab), dubbelteikensegmente (ORF1ab, N of E), en drieteikensegmente (ORF1ab, N en E).Die verskil tussen opsporing en interpretasie, nukleïensuur-ekstraksie en intydse fluoresserende RT-PCR-reaksiestelsel moet na die relevante stelinstruksies verwys, en dit word aanbeveel dat gebruikers die interpretasiemetode wat in die stelinstruksies gespesifiseer word vir interpretasie streng volg.Die algemene streke, primers en probe-volgordes wat deur intydse fluoresserende RT-PCR geamplifiseer word, word in P3 getoon.

P3 Die ligging van die SARS-CoV-2 amplikonteiken op die genoom en die volgorde van primers en probes

Interpretasie van die resultate van SARS-CoV-2 nukleïensuurbepaling (Raal-Time fluoresserende RT-PCR)

“Pneumonie-voorkoming- en beheerplan vir SARS-CoV-2-infeksie (Tweede uitgawe)” het vir die eerste keer die kriteria vir die beoordeling van die resultate van enkelgeenamplifikasie verduidelik:

1. Geen Ct of Ct≥40 is negatief nie;

2. Ct<37 is positief;

3. Die Ct-waarde van 37-40 is die grysskaal area.Dit word aanbeveel om die eksperiment te herhaal.As die resultaat van die oordoen van Ct<40 en die versterkingskurwe duidelike pieke het, word die monster as positief beoordeel, anders is dit negatief.”

Die derde uitgawe van die gids en die vierde uitgawe van die gids het die bogenoemde kriteria voortgesit.As gevolg van die verskillende teikens wat in kommersiële stelle gebruik word, het die voorgenoemde 3de uitgawe van die gids egter nie die kriteria vir die bepaling van die kombinasie van teikens gegee nie, met die klem op die instruksies wat deur die vervaardiger verskaf word, sal geld.Vanaf die vyfde uitgawe van die riglyne is twee teikens uitgeklaar, veral die beoordelingskriteria vir 'n enkele teiken wat moeilik is om te beoordeel.Dit wil sê, as die laboratorium wil bevestig dat 'n geval positief is vir SARS-CoV-2 nukleïensuuropsporing, moet aan die volgende voldoen word aan 1 van 2 voorwaardes:

(1) Twee teikens van SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) in dieselfde monster word positief getoets deur intydse fluoresserende RT-PCR.As 'n enkele teiken positief is, word her-monsterneming en hertoetsing vereis.As die toetsresultate is As die enkele teiken steeds positief is, word dit as positief beoordeel.

(2) Twee monsters van intydse fluoresserende RT-PKR het 'n enkele teiken positief op dieselfde tyd getoon of twee monsters van dieselfde tipe het 'n enkele teiken positiewe toetsresultaat getoon, wat as positief beoordeel kan word.Die riglyne beklemtoon egter ook dat die negatiewe resultate van nukleïensuurtoetsing nie SARS-CoV-2-infeksie kan uitsluit nie.Faktore wat vals negatiewe kan veroorsaak, moet uitgesluit word, insluitend swak monsterkwaliteit (respiratoriese monsters van orofarynks en ander dele), monsterversameling te vroeg of te laat, Monsters is nie korrek gestoor, vervoer en verwerk nie, en die tegnologie self het probleme gehad (virusvariasie, PCR-inhibisie), ens.

Oorsake van vals negatiewe in die SARS-CoV-2-opsporing

Die konsep van "vals negatief" in nukleïensuurtoetsing wat tans ter sprake is, verwys dikwels na "vals negatiewe" waarin die nukleïensuurtoetsresultate nie ooreenstem met kliniese manifestasies nie, dit wil sê, kliniese simptome en beeldresultate word hoogs verdink van COVID-19, maar nukleïensuurtoetse is altyd "negatief" baie keer.Die Kliniese Laboratoriumsentrum van die Nasionale Gesondheidskommissie het die “vals negatiewe” SARS-CoV-2-toets verduidelik.

(1) Daar is 'n sekere hoeveelheid virus in die selle van die besmette persoon.Bestaande data toon dat nadat die liggaam deur die virus besmet is, die virus die keel deur die neus en mond binnedring, dan na die tragea en brongi, en dan die alveoli bereik.Die besmette persoon sal die inkubasietydperk, ligte simptome ervaar, en dan die proses van ernstige simptome, en verskillende stadiums van die siekte.En die hoeveelheid virus wat in verskillende dele van die liggaam teenwoordig is, verskil.

Wat die viruslading van seltipes betref, alveolêre epiteelselle (onderste lugweg)> lugwegepiteelselle (boonste lugweg)> fibroblaste, endoteelselle en makrofage, ens.;van die monstertipe, alveolêre spoelvloeistof (die mees Uitstekende)>diep hoessputum>nasofaryngeale depper>orofaryngeale depper>bloed.Daarbenewens kan die virus ook in ontlasting opgespoor word.Met inagneming van die gerief van operasie en die aanvaarding van pasiënte, is die algemeen gebruikte kliniese monsterbestelling egter orofaryngeale depper>nasofaryngeale depper>brongiale spoelvloeistof (komplekse operasie) en diep sputum (gewoonlik droë hoes, moeilik om te verkry).

Daarom is die hoeveelheid virus in die selle van die orofarynks of nasofarinks van sommige pasiënte klein of uiters laag.Indien slegs monsters van die orofarinks of nasofarinks geneem word vir toetsing, sal die virale nukleïensuur nie opgespoor word nie.

(2) Geen virusbevattende selle is tydens monsterversameling versamel nie, of virale nukleïensuur is nie effektief bewaar nie.

[① Onbehoorlike versamelplek, byvoorbeeld, wanneer orofaryngeale deppers versamel word, is die versamelingdiepte nie genoeg nie, die versamelde nasofaryngeale deppers word nie diep in die neusholte versamel nie, ens. Die meeste van die selle wat versamel word, kan virusvrye selle wees;

②Monsterdeppers word verkeerd gebruik.Byvoorbeeld, sintetiese vesels soos PE-vesel, poliëstervesel en polipropileenvesel word aanbeveel vir die materiaal van die depperkop.Natuurlike vesels soos katoen word in die werklike werking gebruik (sterk adsorpsie van proteïen en nie maklik om uit te was nie) En nylonvesels (swak waterabsorpsie, wat lei tot onvoldoende monsternemingsvolume);

③ Verkeerde gebruik van virusopbergbuise, soos misbruik van polipropileen- of poliëtileenplastiekopbergbuise wat maklik is om nukleïensure (DNA/RNA) te absorbeer, wat lei tot 'n afname in die konsentrasie van nukleïensuur in die stooroplossing.In die praktyk word dit aanbeveel om poliëtileen-propileen polimeer plastiek en 'n paar spesiaal behandelde polipropileen plastiek houers te gebruik om virale nukleïensure te stoor.]

[① Onbehoorlike versamelplek, byvoorbeeld, wanneer orofaryngeale deppers versamel word, is die versamelingdiepte nie genoeg nie, die versamelde nasofaryngeale deppers word nie diep in die neusholte versamel nie, ens. Die meeste van die selle wat versamel word, kan virusvrye selle wees;

②Monsterdeppers word verkeerd gebruik.Byvoorbeeld, sintetiese vesels soos PE-vesel, poliëstervesel en polipropileenvesel word aanbeveel vir die materiaal van die depperkop.Natuurlike vesels soos katoen word in die werklike werking gebruik (sterk adsorpsie van proteïen en nie maklik om uit te was nie) En nylonvesels (swak waterabsorpsie, wat lei tot onvoldoende monsternemingsvolume);

③ Verkeerde gebruik van virusopbergbuise, soos misbruik van polipropileen- of poliëtileenplastiekopbergbuise wat maklik is om nukleïensure (DNA/RNA) te absorbeer, wat lei tot 'n afname in die konsentrasie van nukleïensuur in die stooroplossing.In die praktyk word dit aanbeveel om poliëtileen-propileen polimeer plastiek en 'n paar spesiaal behandelde polipropileen plastiek houers te gebruik om virale nukleïensure te stoor.]

(4) Die kliniese laboratorium operasie is nie gestandaardiseer nie.Monstervervoer en bergingstoestande, gestandaardiseerde werking van kliniese laboratoriums, resultaatinterpretasie en kwaliteitbeheer is die sleutelfaktore om die akkuraatheid en betroubaarheid van toetsresultate te verseker.Volgens die resultate van die eksterne gehalte-evaluering wat deur die Kliniese Laboratoriumsentrum van die Nasionale Gesondheidskommissie op 16-24 Maart 2020 uitgevoer is, van die 844 laboratoriums wat geldige resultate ontvang het, was 701 (83.1%) gekwalifiseer, en 143 (16.9%) nie.Gekwalifiseerd, die algehele laboratoriumtoetstoestande is goed, maar verskillende laboratoriums het steeds verskille in personeeloperasievermoë, enkel-teiken positiewe monster interpretasievermoë en kwaliteitbeheer.

Hoe om die vals negatiewe van SARS-CoV-2 nukleïensuuropsporing te verminder?

Die vermindering van vals negatiewe in nukleïensuuropsporing moet geoptimaliseer word uit die vier aspekte van die vervaardiging van vals negatiewe.

(1)Daar is 'n sekere hoeveelheid virus in die selle van die besmette persoon.Die konsentrasie van die virus in verskillende dele van die liggaam van vermoedelik besmette persone sal op verskillende tye verskil.As daar geen farinks is nie, kan dit in brongiale spoelvloeistof of ontlasting wees.As verskeie soorte monsters gelyktydig of op verskillende stadiums van siekteprogressie vir toetsing versamel kan word, sal dit help om vals negatiewe te vermy.

(2) Selle wat virus bevat moet tydens monsterversameling versamel word.Hierdie probleem kan in 'n groot mate opgelos word deur die opleiding van monsterversamelaars te versterk.

(3) Betroubare IVD-reagense.Deur navorsing oor die opsporingsprestasie-evaluering van reagense op nasionale vlak uit te voer, en die bestaande probleme te bespreek, kan die opsporingsdoeltreffendheid van reagense verder verbeter word en die sensitiwiteit van analise kan verbeter word.

(4) Gestandaardiseerde werking van kliniese laboratoriums.Deur die opleiding van laboratoriumpersoneel te versterk, die laboratoriumkwaliteitbestuurstelsel voortdurend te verbeter, redelike verdelings te verseker en die vermoë van personeel om op te spoor te verbeter, is dit moontlik om vals negatiewe as gevolg van onbehoorlike laboratoriumbedrywighede te verminder.

Redes vir die hertoets positief van SARS-CoV-2 nukleïensuurtoets in herstelde en ontslaan pasiënte

Die “COVID-19 Diagnose and Treatment Plan (Trial Seventh Edition)” stipuleer duidelik dat een van die kriteria vir COVID-19 pasiënte om genees en uit die hospitaal ontslaan te word, is dat twee opeenvolgende respiratoriese kanaalmonsters 'n negatiewe nukleïensuurtoets het (ten minste 24 uur uitmekaar), maar daar is baie min Die SARS-CoV-2-pasiënte was weer positief in verskeie nukleïensuur-ontladings-pasiënte.

(1) SARS-CoV-2 is 'n nuwe virus.Dit is nodig om die patogeniese meganisme daarvan, die volledige prentjie van die siekte wat veroorsaak word en die kenmerke van die siekteverloop verder te verstaan.Daarom is dit aan die een kant nodig om die bestuur van ontslag pasiënte te versterk en 14-dae mediese waarneming uit te voer.Voer opvolg, gesondheidsmonitering en gesondheidsvoorligting uit om die begrip van die hele proses van die voorkoms, ontwikkeling en uitkoms van die siekte te verdiep.

(2) Die pasiënt kan weer met die virus besmet wees.Akademikus Zhong Nanshan het gesê: Omdat geneesde pasiënte teenliggaampies het, kan SARS-CoV-2 deur teenliggaampies uitgeskakel word wanneer hulle weer binnedring.Daar is baie redes, wat die oorsaak van die herstelde pasiënt kan wees, of dit kan verband hou met die mutasie van die virus, of selfs die oorsaak van laboratoriumtoetse.As dit die virus self is, kan die SARS-CoV-2-mutasie veroorsaak dat die teenliggaampie wat deur die herstelde pasiënt geproduseer word, ondoeltreffend teen die gemuteerde virus is.As die pasiënt weer met die gemuteerde virus besmet is, kan die nukleïensuurtoets weer positief wees.

(3) Wat laboratoriumtoetsmetodes betref, het elke toetsmetode sy beperkings.SARS-CoV-2 nukleïensuuropsporing is te danke aan die keuse van geenvolgorde, die samestelling van reagense, die sensitiwiteit van die metode en ander redes, wat daartoe lei dat die bestaande kits hul eie laer opsporingslimiete het.Nadat die pasiënt behandel is, neem die virus in die liggaam af.Wanneer die virale lading in die monster wat getoets moet word onder die onderste limiet van opsporing is, sal 'n "negatiewe" resultaat verskyn.Hierdie resultaat beteken egter nie dat die virus in die liggaam heeltemal verdwyn het nie.Die virus kan wees nadat die behandeling gestaak is.Resurgence”, gaan voort om te kopieer.Daarom word dit aanbeveel om een ​​keer per week binne 2 tot 4 weke na ontslag te hersien.

(4) Nukleïensuur is die genetiese materiaal van die virus.Die virus word doodgemaak nadat die pasiënt antivirale behandeling ondergaan het, maar die oorblywende virale RNA-fragmente word steeds in die menslike liggaam behou, en word nie heeltemal uit die liggaam ontslaan nie.Soms, onder sekere omstandighede, kan dit meer behou word.'n Lang tyd, en op hierdie tydstip sal die nukleïensuurtoets "verbygaande" positief wees.Met die verlenging van die pasiënt se hersteltyd, nadat die oorblywende RNA-fragmente in die liggaam geleidelik uitgeput is, kan die nukleïensuurtoetsuitslag negatief word.

(5) Die nukleïensuurtoetsuitslag van SARS-CoV-2 bewys slegs die teenwoordigheid of afwesigheid van virale RNA, en kan nie die aktiwiteit van die virus bewys en of die virus oordraagbaar is nie.Dit is nodig om te bewys of 'n pasiënt wat weer 'n positiewe nukleïensuurtoets het, weer 'n bron van infeksie sal word.Dit is nodig om viruskultuur op kliniese monsters uit te voer en 'n "lewende" virus te kweek om te bewys dat dit aansteeklik is.

Opsomming

Samevattend, SARS-CoV-2-nukleinsuurtoets vals negatiewe, hertoets positiewe en ander toestande wat nie met kliniese manifestasies strook nie, kan nie heeltemal vermy word nie.In werklike sifting en toetsing word dit aanbeveel om kliniese simptome, beeldondersoeke (CT) en eksperimente te kombineer. Laboratoriumtoets (nukleïensuurtoets + virusspesifieke teenliggaamtoets) resultate vir omvattende diagnose om gemis diagnose en verkeerde diagnose te voorkom.As daar gevind word dat die toetsresultate ooglopend strydig is met die kliniese manifestasies, word dit aanbeveel om 'n omvattende ontleding van die hele toetsskakel (monsterversameling, sirkulasie en verwerkingskakels) uit te voer om SARS-CoV-2 virus vroeë infeksie, herhalende infeksie of gekombineer met ander respiratoriese virusinfeksies, ens moontlik uit te sluit.Indien toestande dit toelaat, word dit aanbeveel om meer sensitiewe monsters soos sputum of alveolêre spoelvloeistof te versamel vir herondersoek.

Verwante Produkte:

SARS-CoV-2 Nukleïensuur Opsporing Kit (Multipleks PCR Fluorescent Probe Metode)