Die verifikasie van die werkverrigting van primers en probes in die vroeë stadium van PCR-reagense en die bepaling van die mees geskikte reaksietoestande is die voorvereistes om die gladde vordering van formele eksperimente te verseker.
So hoe moet ons die primer-sonde in die vroeë stadium bevestig?
Die hoofaanwysers is basislyn, versterkingskromme, ct-waarde, versterkingsdoeltreffendheid, lae-konsentrasie monster opsporing, CV, ens.
Basislyn
Die basislyn is die horisontale lyn in die PCR-amplifikasiekurwe.In die eerste paar siklusse van die PCR amplifikasie reaksie verander die fluoressensie sein nie veel nie en vorm 'n reguit lyn.Hierdie reguit lyn is die basislyn.
Let op of die basislyn vlak is wanneer u PCR-primerprobes ondersoek.Die suiwerheid van die primer probe konsentrasie sal die basislyn beïnvloed, soos om die basislyn te laat styg of daal.Die basislyn is ook 'n baie intuïtiewe aanwyser.
Versterkingskurwe
Nog 'n intuïtiewe aanwyser is die vorm van die versterkingskromme.Dit is die beste om 'n S-vormige kurwe te hê om sekondêre versterking of ander abnormale versterkingskurwes te vermy.
Ct waarde
Die aantal siklusse wat ooreenstem met die buigpunt vanaf die basislyn na die eksponensiële groei is die Ct-waarde.
Vir dieselfde monster lei verskillende primerprobes tot verskillende amplifikasiekurwes, en die ooreenstemmende Ct-waarde sal beïnvloed word deur die amplifikasiedoeltreffendheid en interferensiegraad.In teorie, hoe kleiner die Ct-waarde van die primer-sonde wat ons kies, hoe beter.
Versterkingsdoeltreffendheid
Een van die mees betroubare en stabiele metodes vir die evaluering van PCR-amplifikasiedoeltreffendheid is die standaardkurwe, wat ook wyd deur navorsers erken word.Die metode behels die maak van 'n reeks monsters om die relatiewe aantal teikensjablone te beheer.Hierdie monsters word gewoonlik gemaak deur reeksverdunnings van gekonsentreerde voorraadoplossings, die mees algemeen gebruik is 10-voudige verdunning.Gebruik 'n reeks verdunde monsters, gebruik standaard qPCR-program om te amplifiseer om die Cq-waarde te verkry, en teken uiteindelik 'n standaardkromme volgens die konsentrasie van elke monster en die ooreenstemmende Cq-waarde om die lineêre vergelyking Cq= -klgX0+b, en die amplifikasiedoeltreffendheid E=10(-1 /k)-1 te verkry.Wanneer qPCR vir kwantitatiewe analise gebruik word, moet die amplifikasiedoeltreffendheid in die reeks van 90%-110% (3.6>k>3.1) wees.
Lae-konsentrasie monsteropsporing
Wanneer die monsterkonsentrasie laag is, is die opsporingstempo's van verskillende primerprobes verskillend.Ons kies 20 lae-konsentrasie monsters om te herhaal, en die primer-probe-stelsel met die hoogste opsporingstempo is die beste.
Variasiekoëffisiënt (CV)
10 duplikaatmonsters kan opgespoor word met verskillende primer probes volgens die lynstandaard van die reagens vir nukleïensuur amplifikasie opsporing.
Kwantitatiewe reagense:
Akkuraatheid
Die akkuraatheid binne een bondel moet voldoen: die variasiekoëffisiënt (CV,%) van die logaritmiese waarde van die toetskonsentrasie is ≤5%.Wanneer die monsterkonsentrasie laag is, is die variasiekoëffisiënt (CV,%) van die logaritme van die opsporingskonsentrasie ≤10%
Kwalitatiewe reagense:
Akkuraatheid
Die akkuraatheid binne een bondel moet voldoen aan:
(1) Koëffisiënt van variasie van Ct-waarde (CV,%) ≤5%
Dieselfde monster word vir 10 keer parallel getoets, en die toetsresultate moet konsekwent wees
Postyd: 18-Sep-2021
