Ek glo dat almal altyd sulke of sulke probleme sal teëkom wanneer hulle PCR-reaksies doen, maar die meeste van hulle kan in twee hoofprobleme geklassifiseer word:

Te min amplifikasie van die geen templaat (amplifikasie);
Te veel nie-teiken geen amplifikasie.
Die gebruik van bymiddels is een van die algemene strategieë om hierdie probleme op te los.Gewoonlik het die rol van bymiddels twee aspekte:
sekondêre struktuurvan gene (sekondêre struktuur);
Verminder nie-spesifieke priming.
Vandag sal die redakteur kortliks aan jou die algemene bymiddels in PCR-reaksies en hul funksies bekendstel.
Bymiddels wat sekondêre struktuur verminder
sulfoksied(DMSO)
geenmonstersmet 'n hoë GC-inhoud.DMSO verminder egter ook Taq-polimerase-aktiwiteit aansienlik.Daarom moet almal die sjabloontoeganklikheid en die aktiwiteit van die polimerase balanseer.Die redakteur stel voor dat jy verskillende konsentrasies van DSMO kan probeer, soos van 2% tot 10%, om die konsentrasie te vind wat by jou eksperiment pas.
Nie-ioniese skoonmaakmiddels
Nie-ioniese skoonmaakmiddels, soos 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 of NP-40, verminder gewoonlik DNA se sekondêre struktuur.Alhoewel dit die amplifikasie van die templaatgeen kan verhoog, sal dit ook die moeilikheid van nie-spesifieke amplifikasie veroorsaak.So, hierdie bymiddels werk goed vir lae-opbrengs PCR-reaksies sonder puin, maar nie so goed vir relatief onsuiwer PRC-reaksies nie.Nog 'n voordeel van nie-ioniese skoonmaakmiddels is die vermindering van SDS-kontaminasie.Gewoonlik sal SDS tydens die DNA-ekstraksieproses na die PCR-stap gebring word, wat die aktiwiteit van die polimerase grootliks inhibeer.Daarom kan die byvoeging van 0,5% Tween-20 of Tween-40 by die reaksie die negatiewe effekte van SDS neutraliseer.
Betaine_
Betaïne kan DNA-amplifikasie verbeter deur die vorming van sekondêre struktuur te verminder en is oor die algemeen 'n "raaisel" toevoeging tot kommersiële PCR-stelle.As jy betaïen wil gebruik, moet jy betaïen of betaïenmonohidraat (Betaine of Betaïenmonohidraat) sit, maar nie betaïenhidrochloried (Betaine HCl) nie, pas by 'n finale konsentrasie van 1-1.7M.Betaïne kan ook help om spesifisiteit te verbeter omdat dit die basispaarsamestellingsafhanklikheid van DNA-smelting/DNA-denaturering uitskakel.
Bymiddels om nie-spesifieke priming te verminder
Formamied
Formamied is 'n algemeen gebruikte organiese PCR-bymiddel.Dit kan kombineer met hoofgroef en klein groef in DNA, waardeur die stabiliteit van die meester DNA dubbelheliks verminder word en die smelttemperatuur van DNA verlaag word.Die konsentrasie formamied wat in PCR-eksperimente gebruik word, is gewoonlik 1%-5%.
Tetrametielammoniumchloried( TMAC)
Tetrametielammoniumchloried kan die spesifisiteit van hibridisasie (hibridisering spesifisiteit) verhoog en die smelttemperatuur van DNA verhoog.Dus kan TMAC nie-spesifieke priming verwyder en verkeerde binding van DNA en RNA verminder.As jy gebruikgedegenereerde primersin die PCR-reaksie, onthou om TMAC by te voeg, wat algemeen gebruik word teen 'n konsentrasie van 15-100mM.
Ander algemene bymiddels
Benewens die twee kategorieë bymiddels hierbo genoem, is daar baie algemene bymiddels in PCR-reaksies, hoewel hulle verskillende funksies het, is hulle ook baie belangrik.
Magnesium ioon
Magnesiumioon is 'n onontbeerlike kofaktor (kofaktor) van polimerase, dit wil sê, sonder magnesiumioon is polimerase onaktief.Te veel magnesiumione kan egter ook die doeltreffendheid van die polimerase beïnvloed.Die konsentrasie van magnesiumione in elke PCR-reaksie sal verskil.Chelerende middels (soos EDTA of sitraat), die konsentrasie van dNTP's en proteïene beïnvloed almal die konsentrasie van magnesiumione.Dus, as jy probleme met jou PCR-eksperiment het, kan jy probeer om verskillende magnesiumioonkonsentrasies te verander, byvoorbeeld van 1.0 na 4.0mM, met 'n interval van 0.5–1mM tussenin.
Dit is opmerklik dat veelvuldige vries-ontdooi-siklusse kan lei tot konsentrasiestratifikasie van die magnesiumchloriedoplossing.Daarom moet jy dit heeltemal oplos voor elke gebruik, en goed meng voordat jy dit gebruik.
Bees serum albumien(Beesalbumien, BSA)
In molekulêre chemie-eksperimente is beeserumalbumien 'n baie algemene toevoeging, veral in beperkingsensiemvertering en PCR-eksperimente.In PCR-reaksies is BSA nuttig om kontaminante soos fenoliese verbindings te verminder.En daar word ook gesê dat dit die adhesie van reaktante aan die wand van die proefbuis kan verminder.In die PCR-reaksie kan die konsentrasie BSA wat bygevoeg word gewoonlik 0,8 mg/ml bereik.
 
Verwante Produkte:
PCR held(met kleurstof)
PCR held