Onderlaag-ontwerpbasis (99% probleme kan opgelos word)
1. Onderlaaglengte: Die handboek vereis 15-30bp, gewoonlik ongeveer 20bp.Die werklike toestand is beter om 18-24bp te wees om die spesifisiteit te verseker, maar hoe langer hoe beter, te lang primer sal ook die spesifisiteit verminder, en die opbrengs verminder.
2. Primer amplifikasie span: 200-500bp is gepas, en die fragment kan uitgebrei word na 10kb onder spesifieke omstandighede.
3. Primer basis: Die inhoud van G+C moet 40-60% wees, te min G+C amplifikasie effek is nie goed nie, te veel G+C is maklik om nie-spesifieke bande te verskyn.ATGC word die beste ewekansig versprei, en vermy trosse van meer as 5 purien- of pirimidien-nukleotiede.Multi-gc vir die 5'-kant en intermediêre reekse om stabiliteit te verhoog, vermy ryk GC aan die 3'-kant, geen GC vir die laaste 3 basisse, of geen GC vir 3 van die laaste 5 basisse.
4. Vermy sekondêre struktuur in primers, en vermy komplementering tussen twee primers, veral komplementering aan die 3 'end, anders sal primer dimeer gevorm word en nie-spesifieke geamplifiseerde bande gegenereer word.
5. Die basisse aan die 3'-kant van primers, veral die laaste en voorlaaste basisse, moet streng gepaar word om PCR-mislukking as gevolg van ongepaarde terminale basisse te vermy.
6. Primers het of kan bygevoeg word met toepaslike splitsingsplekke, en die geamplifiseerde teikenvolgorde moet verkieslik toepaslike splitsingsplekke hê, wat baie voordelig is vir splitsingsanalise of molekulêre kloning.
7. Spesifisiteit van primers: primers behoort geen ooglopende homologie met ander volgordes in die nukleïensuurvolgordedatabasis te hê nie.
8. Leer om sagteware te gebruik: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Hierdie aanlyn ontwerp werk die beste).
Bogenoemde inhoud kan ten minste 99% van onderlaagontwerpprobleme oplos.
Beheer die besonderhede van onderlaagontwerp
1. Onderlaag lengte
Algemene onderlaaglengte is 18~30 basisse.Oor die algemeen is die belangrikste faktor wat die uitgloeitemperatuur van die onderlaag bepaal, die lengte van die onderlaag.Die uitgloeitemperatuur van onderlaag word oor die algemeen gekies (Tm-waarde -5℃), en sommige gebruik Tm-waarde direk.Die volgende formules kan gebruik word om rofweg die uitgloeitemperatuur van primers te bereken.
Wanneer die lengte van primer minder as 20bp is: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Wanneer die lengte van onderlaag groter as 20bp is: 62.3℃+0.41℃(%GC)-500/lengte-5℃
Daarbenewens kan baie sagteware ook gebruik word om die uitgloeitemperatuur te bereken, die berekeningsbeginsel sal anders wees, so soms kan die berekende waarde 'n klein gaping hê.Om PCR-reaksies te optimaliseer, word die kortste primers wat uitgloeitemperature van nie minder nie as 54℃ verseker gebruik vir die beste doeltreffendheid en spesifisiteit.
Algehele, primer spesifisiteit verhoog met 'n faktor van vier vir elke bykomende nukleotied, sodat die minimum primer lengte vir die meeste toepassings 18 nukleotiede is.Die boonste limiet van onderlaaglengte is nie baie belangrik nie, hoofsaaklik verwant aan reaksiedoeltreffendheid.As gevolg van entropie, hoe langer die primer, hoe laer is die tempo waarteen dit uitgloei om aan die teiken-DNS te bind om 'n stabiele dubbelstring-sjabloon te vorm vir DNA-polimerase om te bind.
Wanneer sagteware gebruik word om primers te ontwerp, kan die lengte van primers op sy beurt bepaal word deur TM waarde, veral vir primers van fluoressensie kwantitatiewe PCR, TM=60℃ of so moet beheer word.
2.GC inhoud
Oor die algemeen is die inhoud van G+C in primer rye 40%~60%, en GC inhoud en Tm waarde van 'n paar primers moet gekoördineer word.As die primer 'n ernstige GC- of AT-neiging het, kan gepaste hoeveelheid A, T of G en C-stert by die 5'-kant van die primer gevoeg word.
3. Uitgloeiingstemperatuur
Die uitgloeitemperatuur moet 5 ℃ laer wees as die ontkettingtemperatuur.As die aantal primerbasisse klein is, kan die uitgloeitemperatuur gepas verhoog word, wat die spesifisiteit van PCR kan verhoog.As die aantal basisse groot is, kan die uitgloeitemperatuur gepas verlaag word.Die uitgloeitemperatuurverskil tussen 'n primerspaar van 4℃ ~ 6℃ sal nie die PKR-opbrengs beïnvloed nie, maar ideaal gesproke is die uitgloeitemperatuur van 'n primerspaar dieselfde, wat kan wissel tussen 55℃ ~ 75℃.
4. Vermy die sekondêre struktuurarea van die versterkingssjabloon
Dit is die beste om die sekondêre struktuurgebied van die sjabloon te vermy wanneer die versterkte fragment gekies word.Die stabiele sekondêre struktuur van die teikenfragment kan deur relevante rekenaarsagteware voorspel en beraam word, wat nuttig is vir sjabloonkeuse.Eksperimentele resultate toon dat die uitbreiding dikwels onsuksesvol is wanneer die vrye energie (△G) van die streek wat uitgebrei moet word minder as 58.6lkJ/mol is.
5. Mispassing met teiken-DNS
Wanneer die geamplifiseerde teiken-DNS-volgorde groot is, kan 'n primer aan verskeie dele van die teiken-DNS bind, wat daartoe lei dat veelvuldige bande in die resultaat verskyn.Hierdie keer is dit nodig om die BLAST sagteware toets, webwerf te gebruik:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Kies Belyn twee rye (bl2seq).
Om primer-volgordes na sone 1 te plak en teiken-DNS-volgordes na sone 2 is uitruilbaar, en BLAST bereken komplementêre, antisense en ander moontlikhede, sodat gebruikers nie hoef agter te kom of albei kettings sintuigkettings is nie.Jy kan ook die GI-nommer invoer as jy die GI-nommer van die ry in die databasis ken, so jy hoef nie 'n groot gedeelte van die ry te plak nie.Ten slotte, klik Belyn by 3 om te sien of die primer verskeie homoloë plekke in die teiken DNA het.
6. Primer terminaal
Die 3' einde van die onderlaag is waar die verlenging begin, so dit is belangrik om te verhoed dat wanpassings daar begin.Die 3 '-einde moet nie meer as 3 opeenvolgende G of C wees nie, want dit sal veroorsaak dat die primer verkeerdelik in die G+C-verrykingsvolgordestreek geaktiveer word.Die 3 'end kan geen sekondêre struktuur vorm nie, behalwe in spesiale PCR (AS-PCR) reaksies, kan die 3' einde van die primer nie wanpas nie.Byvoorbeeld, as die enkoderende streek geamplifiseer word, moet die 3'-einde van primer nie by die derde posisie van kodon getermineer word nie, want die derde posisie van kodon is geneig om te degenereer, wat die spesifisiteit en doeltreffendheid van amplifikasie sal beïnvloed.Wanneer anneksasie primers gebruik word, verwys na die kodongebruikstabel, let op biologiese voorkeur, moenie anneksasie primers aan die 3'-punt gebruik nie, en gebruik 'n hoër konsentrasie primers (1uM-3uM).
7. Sekondêre struktuur van primers
Die primers self moet nie komplementêre volgordes hê nie, anders sal die primers self in haarnaaldstrukture vou, en hierdie sekondêre struktuur sal die binding van primers en templates beïnvloed as gevolg van steriese hindering.As kunsmatige oordeel gebruik word, moet die aaneenlopende komplementêre basisse van primers self nie groter as 3bp wees nie.Daar behoort geen komplementariteit tussen die twee primers te wees nie, veral die komplementêre oorvleueling van die 3 'end moet vermy word om die vorming van primer dimere te voorkom.Oor die algemeen behoort daar nie meer as 4 opeenvolgende basisse homologie of komplementariteit tussen 'n paar primers te wees nie.
8. Voeg merkers of lokusse by
Die 5 'end het min effek op amplifikasie-spesifisiteit en kan dus gewysig word sonder om amplifikasie-spesifisiteit te beïnvloed.Die modifikasie van primer 5 'end het ingesluit: byvoeging van ensiembeperkingsplek;Gemerkte biotien, fluoressensie, digoksien, Eu3+, ens. Stel proteïenbindende DNA-volgordes bekend;Die bekendstelling van mutasieplekke, die invoeging en ontbreken van mutasievolgordes en die bekendstelling van promotorvolgordes, ens. Die ekstra basisse sal min of meer die doeltreffendheid van amplifikasie beïnvloed en die kans op primer dimeer vorming verhoog, maar 'n paar toegewings moet gemaak word vir die volgende stap.Bykomende volgordes wat nie op die teikenvolgorde bestaan nie, soos beperkingsplekke en promotorvolgordes, kan by die 5'-punt van die primer gevoeg word sonder om spesifisiteit te beïnvloed.Hierdie rye word nie by die berekening van primer Tm-waardes ingesluit nie, maar moet getoets word vir komplementariteit en interne sekondêre struktuur.
9. Subklone
Die meeste van die tyd is PCR slegs voorlopige kloning, en dan moet ons die teikenfragment in verskeie vektore subkloneer, so ons moet addisionele basisse ontwerp vir die volgende operasie in die PCR-stap.
Sommige reekse wat vir subkloning ontwerp is, word hieronder opgesom.
Beperkingsendonuklease-beperkingsplek is bygevoeg
Die byvoeging van ensiembeperkingsplekke is die mees gebruikte metode vir subkloning van PCR-produkte.Oor die algemeen, die splitsing plek is ses basisse, bykomend tot die 5 'end van die splitsing plek moet 2 ~ 3 beskermende basisse by te voeg.Die aantal beskermende basisse wat deur verskillende ensieme benodig word, verskil egter.SalⅠ vereis byvoorbeeld geen beskermende basis nie, EcoRⅤ vereis 1 beskermende basis, NieⅠ vereis 2 beskermende basisse, en Hind Ⅲ vereis 3 beskermende basisse.
LIC voeg die stert by
Die volle naam van LIC is Ligation-Independent kloning, 'n kloningsmetode wat spesifiek deur Navogen uitgevind is vir sy deel van die pET vektor.Die pET-draer wat deur die LIC-metode voorberei is, het nie-komplementêre 12-15 basis enkelstring taai punte, wat die ooreenstemmende taai punte op die teikeninsetselfragment komplementeer.Vir amplifikasiedoeleindes moet die primer 5'-volgorde van die ingevoegde fragment die LIC vektor komplementeer.Die 3′→5′ ekstranek-aktiwiteit van T4 DNA-polimerase kan na 'n kort tyd 'n enkelstring taai punt op die ingevoegde fragment vorm.Omdat die produk slegs gevorm kan word uit die wedersydse uitgloeiing van die voorbereide insetselfragment en die vektor, is hierdie metode baie vinnig en doeltreffend, en dit is gerigte kloning.
Gerig TA kloon voeg stert
TA-kloning kon nie die fragment in 'n vektor teiken nie, so later het Invitrogen 'n vektor bekendgestel wat kloning kon teiken, wat vier prominente basis GTGGS aan die een kant bevat het.Daarom, in die ontwerp van PCR-primers, moet komplementêre volgordes dienooreenkomstig bygevoeg word, sodat fragmente "georiënteer" kan word.
As jy min tyd het, kan jy direkte sintese probeer, deur die geen met die vektor te kombineer, wat ons ET-genesintese by musekulêre mense noem.
D. In-Fusie kloning metode
Geen ligase benodig nie, geen lang reaksie nodig nie.Solank as wat 'n volgorde aan beide kante van die gelineariseerde vektor ingebring word In die ontwerp van primers, dan word die PCR-produk en die gelineariseerde vektor in die infusie-ensiemoplossing wat BSA bevat gevoeg en by kamertemperatuur vir 'n halfuur geplaas, kan die transformasie uitgevoer word.Hierdie metode is veral geskik vir groot volume omskakeling.
10. Voeg onderlaag saam
Soms is slegs beperkte volgorde-inligting bekend oor onderlaagontwerp.Byvoorbeeld, as slegs die aminosuurvolgorde bekend is, kan die samesmeltende primer ontwerp word.'n Samesmeltingprimer is 'n mengsel van verskillende volgordes wat al die verskillende basismoontlikhede verteenwoordig wat 'n enkele aminosuur kodeer.Om spesifisiteit te verhoog, kan jy na die kodongebruikstabel verwys om anneksasie te verminder volgens basiese gebruiksvoorkeure van verskillende organismes.Hipoksantien kan met al die basisse gepaar word om die uitgloeitemperatuur van die onderlaag te verlaag.Moenie die aangehegte basisse aan die 3'-kant van die onderlaag gebruik nie, want die uitgloeiing van die laaste 3 basisse aan die 3'-punt is voldoende om PCR op die verkeerde plek te begin.Hoër primerkonsentrasies (1μM tot 3μM) word gebruik omdat primers in baie anneksasiemengsels nie spesifiek vir die teikensjabloon is nie.
PCR grondstowwebeheer
1. Onderlaag hoeveelheid
Die konsentrasie van elke onderlaag is 0,1 ~ 1umol of 10 ~ 100pmol.Dit is beter om die vereiste resultaat te produseer met die laagste hoeveelheid onderlaag.Hoë konsentrasie primer sal wanpassing en nie-spesifieke amplifikasie veroorsaak, en verhoog die kans om dimere tussen primers te vorm.
2. Primer konsentrasie
Die konsentrasie van primers beïnvloed die spesifisiteit.Die optimale onderlaagkonsentrasie is gewoonlik tussen 0.1 en 0.5μM.Hoër primerkonsentrasies lei tot amplifikasie van niespesifieke produkte.
3. Uitgloeitemperatuur van onderlaag
Nog 'n belangrike parameter vir primers is die smelttemperatuur (Tm).Dit is die temperatuur wanneer 50% van die primers en komplementêre rye as dubbelstring DNA-molekules voorgestel word.Tm word benodig om PCR-gloeitemperatuur in te stel.Ideaal gesproke is die uitgloeitemperatuur laag genoeg om effektiewe uitgloeiing van die primers met die teikenvolgorde te verseker, maar hoog genoeg om niespesifieke binding te verminder.Redelike uitgloeitemperatuur van 55 ℃ tot 70 ℃.Uitgloeiingstemperatuur word gewoonlik 5 ℃ laer as Tm van onderlaag ingestel.
Daar is verskeie formules vir die instelling van Tm, wat baie verskil na gelang van die formule wat gebruik word en die volgorde van primers.Omdat die meeste formules 'n geskatte Tm-waarde verskaf, is alle uitgloeiingstemperature slegs 'n beginpunt.Spesifisiteit kan verbeter word deur verskeie reaksies te ontleed wat die uitgloeitemperatuur progressief verhoog.Begin onder die geskatte Tm-5℃, en verhoog die uitgloeitemperatuur geleidelik met 'n toename van 2℃.Hoër uitgloeiingstemperatuur sal die vorming van primer dimere en nie-spesifieke produkte verminder.Vir die beste resultate moet die twee primers benaderde Tm-waardes hê.As die Tm-verskil van primerpare meer as 5℃ is, sal die primers 'n beduidende valse begin toon deur 'n laer uitgloeitemperatuur in die siklus te gebruik.As die twee primers Tm verskil, stel die uitgloeitemperatuur op 5℃ laer as die laagste Tm.Alternatiewelik, om spesifisiteit te verhoog, kan vyf siklusse eers uitgevoer word by uitgloeitemperature wat ontwerp is vir hoër Tm, gevolg deur die oorblywende siklusse by uitgloeitemperature wat ontwerp is vir laer Tm.Dit laat toe dat 'n gedeeltelike kopie van die bestemmingssjabloon onder streng toestande verkry kan word.
4. Primer suiwerheid en stabiliteit
Die standaard suiwerheid van pasgemaakte primers is voldoende vir die meeste PCR-toepassings.Die verwydering van benzoyl- en isobutielielgroepe deur ontsouting is minimaal en meng dus nie met PCR in nie.Sommige toepassings vereis suiwering om enige nie-vollengte-reekse in die sinteseproses te verwyder.Hierdie afgekapte rye vind plaas omdat die doeltreffendheid van DNA-sintesechemie nie 100% is nie.Dit is 'n sirkelvormige proses wat herhaalde chemiese reaksies gebruik aangesien elke basis bygevoeg word om DNS van 3' tot 5' te maak.Jy kan in enige siklus misluk.Langer primers, veral dié groter as 50 basisse, het 'n groot deel van afgeknotte rye en kan suiwering vereis.
Die opbrengs van primers word beïnvloed deur die doeltreffendheid van sintetiese chemie en suiweringsmetode.Biofarmaseutiese maatskappye, soos Sitologie en Shengong, gebruik almal 'n minimum OD-eenheid om die totale uitset van oligonukleosied te verseker.Pasgemaakte onderlaag word in droë poeiervorm gestuur.Dit is die beste om die primers weer in TE op te los sodat die finale konsentrasie 100μM is.TE is beter as gedeïoniseerde water omdat die pH van water dikwels suur is en die hidrolise van oligonukleosiede sal veroorsaak.
Die stabiliteit van onderlaag hang af van bergingstoestande.Droë poeier en opgeloste onderlaag moet by -20℃ gestoor word.Primers opgelos in TE by konsentrasies groter as 10μM kan stabiel by -20℃ vir 6 maande gestoor word, maar kan slegs by kamertemperatuur (15℃ tot 30℃) vir minder as 1 week gestoor word.Droë poeier onderlaag kan vir ten minste 1 jaar by -20 C gestoor word en by kamertemperatuur (15 C tot 30 C) vir tot 2 maande.
5. Ensieme en hul konsentrasies
Tans is die Taq DNA-polimerase wat gebruik word basies die geen-ingenieurswese ensiem wat deur koliforme bakterieë gesintetiseer word.Die hoeveelheid ensiem wat nodig is om 'n tipiese PCR-reaksie te kataliseer is ongeveer 2.5U (verwys na die totale reaksievolume van 100ul).As die konsentrasie te hoog is, kan dit lei tot nie-spesifieke amplifikasie;as die konsentrasie te laag is, sal die hoeveelheid sintetiese produk verminder word.
6. Kwaliteit en konsentrasie van dNTP
Die kwaliteit van dNTP is nou verwant aan die konsentrasie en die doeltreffendheid van PCR amplifikasie.Die dNTP-poeier is korrelvormig, en sy veranderlikheid verloor sy biologiese aktiwiteit as dit onbehoorlik gestoor word.dNTP-oplossing is suur, en moet in hoë konsentrasie gebruik word, met 1M NaOH of 1M Tris.HCL-bufferoplossing om sy PH aan te pas na 7.0 ~ 7.5, klein hoeveelheid onderverpakking, bevrore berging by -20℃.Veelvuldige vries-ontdooiing sal dNTP afbreek.In PCR-reaksie moet dNTP 50 ~ 200umol/L wees.Veral aandag moet gegee word aan die konsentrasie van die vier DNTPS moet gelyk wees (gelyke mol voorbereiding).As die konsentrasie van enige een van hulle verskil van die ander (hoër of laer), sal wanpassing veroorsaak word.Te lae konsentrasie sal die opbrengs van PCR produkte verminder.dNTP kan met Mg2+ kombineer en die konsentrasie vry Mg2+ verminder.
7. Sjabloon (teikengeen) nukleïensuur
Die hoeveelheid en suiweringsgraad van templaatnukleïensuur is een van die sleutelskakels vir die sukses of mislukking van PCR.Die tradisionele DNA-suiweringsmetodes gebruik gewoonlik SDS en protease K om monsters te verteer en weg te gooi.Die hooffunksies van SDS is: los lipiede en proteïene op die selmembraan op, vernietig sodoende die selmembraan deur membraanproteïene op te los, en dissosieer kernproteïene in die sel, SDS kan ook met proteïene kombineer en neerslaan;Protease K kan proteïene hidroliseer en verteer, veral histone wat met DNA gebind is, en dan organiese oplosmiddelfenol en chloroform gebruik om proteïene en ander selkomponente te onttrek, en etanol of isopropylalkohol gebruik om nukleïensuur te presipiteer.Die onttrekte nukleïensuur kan as 'n templaat vir PCR-reaksies gebruik word.Vir algemene kliniese opsporingmonsters kan 'n vinnige en eenvoudige metode gebruik word om selle op te los, patogene te lyseer, proteïene van chromosome te verteer en te verwyder na vry teikengene, en direk vir PCR-amplifikasie gebruik word.RNA-sjabloonekstraksie gebruik gewoonlik guanidien isothiocyanate of protease K metode om te verhoed dat RNase RNA afbreek.
8.Mg2+ konsentrasie
Mg2+ het 'n beduidende effek op die spesifisiteit en opbrengs van PCR-amplifikasie.In die algemene PCR-reaksie, wanneer die konsentrasie van verskeie dNTP 200umol/L is, is die toepaslike konsentrasie Mg2+ 1,5 ~ 2,0mmol/L.Mg2+ konsentrasie is te hoog, die reaksie spesifisiteit neem af, nie-spesifieke amplifikasie vind plaas, te lae konsentrasie sal die aktiwiteit van Taq DNA polimerase verminder, wat lei tot die vermindering van reaksie produkte.
Magnesiumione beïnvloed verskeie aspekte van PCR, soos DNA-polimerase-aktiwiteit, wat opbrengs beïnvloed;Nog 'n voorbeeld is primer-gloeiing, wat spesifisiteit beïnvloed.dNTP en templaat bind aan magnesiumioon, wat die hoeveelheid vrye magnesiumioon wat benodig word vir ensiemaktiwiteit verminder.Die optimale magnesiumioonkonsentrasie verskil vir verskillende primerpare en sjablone, maar 'n tipiese PCR-beginkonsentrasie met 200μM dNTP is 1.5mM (let wel: Vir intydse kwantitatiewe PCR, gebruik 3 tot 5mM magnesiumioonoplossing met 'n fluoresserende sonde).Hoër konsentrasies vry magnesiumione verhoog opbrengs, maar verhoog ook nie-spesifieke amplifikasie en verlaag getrouheid.Om die optimale konsentrasie te bepaal, is magnesiumioontitrasies uitgevoer in inkremente van 0.5mM vanaf 1mM tot 3mM.Om die afhanklikheid van magnesiumioon-optimalisering te verminder, kan Platinum Taq DNA-polimerase gebruik word.Platinum Taq DNA-polimerase is in staat om funksie oor 'n wyer reeks magnesiumioonkonsentrasies te handhaaf as Taq DNA-polimerase en vereis dus minder optimalisering.
9. Pcr-bevorderende bymiddels
Optimalisering van uitgloeiingstemperatuur, onderlaagontwerp en magnesiumioonkonsentrasie is voldoende vir hoogs spesifieke amplifikasie van die meeste sjablone;sommige sjablone, insluitend dié met 'n hoë GC-inhoud, vereis egter bykomende maatreëls.Bymiddels wat die smelttemperatuur van DNA beïnvloed, bied nog 'n manier om produkspesifisiteit en opbrengs te verbeter.Volledige denaturering van die sjabloon word vereis vir die beste resultate.
Daarbenewens verhoed die sekondêre struktuur primerbinding en ensiemverlenging.
PCR-bymiddels, insluitend formamied, DMSO, gliserien, betaïne en PCRx Enhancer Solution, verbeter amplifikasie.Hul moontlike meganisme is om die smelttemperatuur te verlaag, om sodoende die uitgloeiing van primers te help en DNA-polimerase-verlenging deur die sekondêre struktuurgebied te help.PCRx-oplossing het ander voordele.Minimale magnesiumioonoptimering word vereis wanneer dit gebruik word met Platinum Taq DNA-polimerase en Platinum Pfx DNA-polimerase.Die Platinum-tegniek word dus gekombineer met die bymiddel om spesifisiteit te verhoog terwyl die afhanklikheid van die derde benadering, magnesiumioonoptimering, verminder word.Vir die beste resultate moet die konsentrasie van bymiddels geoptimaliseer word, veral DMSO, formamied en gliserol, wat Taq DNA-polimerase inhibeer.
10. Warm begin
Warmstart PCR is een van die belangrikste metodes om PCR spesifisiteit te verbeter benewens goeie primer ontwerp.Alhoewel die optimale verlengingstemperatuur van Taq DNA-polimerase 72 ℃ is, bly die polimerase aktief by kamertemperatuur.Dus word nie-spesifieke produkte geproduseer wanneer die houtemperatuur laer is as die uitgloeiingstemperatuur tydens die voorbereiding van die PKR-reaksie en aan die begin van die termiese siklus.Sodra dit gevorm is, word hierdie niespesifieke produkte effektief versterk.Warmstart-PCR is veral effektief wanneer die terreine wat vir primerontwerp gebruik word, beperk word deur die ligging van genetiese elemente, soos plekgerigte mutasies, uitdrukkingskloning, of konstruksie en manipulasie van genetiese elemente wat vir DNA-ingenieurswese gebruik word.
'n Algemene metode om die aktiwiteit van Taq DNA-polimerase te beperk, is om PCR-reaksieoplossing op ys voor te berei en dit in 'n voorverhitte PCR-apparaat te plaas.Hierdie metode is eenvoudig en goedkoop, maar dit voltooi nie die aktiwiteit van die ensiem nie en skakel dus nie die amplifikasie van nie-spesifieke produkte heeltemal uit nie.
Termiese priming vertraag DNA-sintese deur 'n noodsaaklike komponent te inhibeer totdat die PKR-apparaat denaturasietemperatuur bereik.Die meeste handmatige termiese inisiasiemetodes, insluitend vertraagde toevoeging van Taq DNA-polimerase, is omslagtig, veral vir hoë-deursettoepassings.Ander termiese primingmetodes gebruik 'n wasskerm om 'n noodsaaklike komponent, insluitend magnesiumione of ensieme, te omsluit, of om reaktiewe komponente, soos sjablone en buffers, fisies te isoleer.Tydens die termiese siklus word die verskillende komponente vrygestel en saam gemeng soos die was smelt.Soos die handmatige warmbeginmetode, is die wasskermmetode omslagtig en vatbaar vir besoedeling en is dit nie geskik vir hoë deursettoepassings nie.
Platinum DNA polimerase is gerieflik en doeltreffend vir outomatiese warmbegin PCR.Platinum Taq DNA-polimerase bestaan uit rekombinante Taq DNA-polimerase gekombineer met monoklonale teenliggaampies teen Taq DNA-polimerase.Die teenliggaampies word deur PCR geformuleer om ensiemaktiwiteit te inhibeer tydens langdurige temperatuurhou.Taq DNA polimerase is vrygestel in die reaksie tydens die 94℃ isolasie van die denaturasie stap, wat volle polimerase aktiwiteit herstel.In teenstelling met chemies gemodifiseerde Taq DNA-polimerase vir termiese inisiasie, benodig Platinum-ensiem nie langdurige isolasie by 94℃ (10 tot 15 minute) om die polimerase te aktiveer nie.Met PlatinumTaq DNA-polimerase is 90% van Taq DNA-polimerase-aktiwiteit na 2 minute by 94℃ herstel.
11. Nest-PCR
Opeenvolgende rondtes van amplifikasie met behulp van geneste primers kan spesifisiteit en sensitiwiteit verbeter.Die eerste rondte is 'n standaardversterking van 15 tot 20 siklusse.'n Klein fraksie van die aanvanklike amplifikasieproduk is 100 tot 1000 keer verdun en vir 15 tot 20 siklusse by die tweede rondte van amplifikasie gevoeg.Alternatiewelik kan die aanvanklike geamplifiseerde produk grootte word deur gel suiwering.'n Geneste primer word gebruik in die tweede rondte van amplifikasie, wat aan die teikenvolgorde binne die eerste primer kan bind.Die gebruik van geneste PCR verminder die moontlikheid van amplifikasie van veelvuldige teikenplekke omdat daar min teikenvolgordes aanvullend tot beide stelle primers is.Dieselfde totale aantal siklusse (30 tot 40) met dieselfde primers het die niespesifieke plekke geamplifiseer.Geneste PCR verhoog die sensitiwiteit van beperkte teikenvolgordes (bv. seldsame mrnas) en verbeter die spesifisiteit van moeilike PCRS (bv. 5' RACE).
12. Dalende PCR
Dalende PCR verbeter spesifisiteit deur die gebruik van stywe uitgloeiingstoestande vir die eerste paar siklusse van PCR.Die siklus begin by 'n uitgloeitemperatuur ongeveer 5℃ hoër as die geskatte Tm, dan word elke siklus verminder met 1℃ tot 2℃ totdat die uitgloeitemperatuur onder Tm 5℃ is.Slegs die bestemmingssjabloon met die hoogste homologie sal versterk word.Hierdie produkte gaan voort om in daaropvolgende siklusse uit te brei, wat die versterkte niespesifieke produkte verdring.Afnemende PCR is nuttig vir metodes waar die mate van homologie tussen primer en teikensjabloon nie bekend is nie, soos AFLP DNA-vingerafdrukke.
Verwante PCR-stelle
Die 2× PCR HeroTMMengstelsel het hoër verdraagsaamheid teenoor PCR-inhibeerders as die gewone PCR-mengstelsel, en kan maklik met PCR-versterking van verskeie komplekse sjablone hanteer.Die unieke reaksiestelsel en hoë-doeltreffendheid Taq Hero maak dat die PCR-reaksie hoër versterkingsdoeltreffendheid, spesifisiteit en sensitiwiteit het.
Hoër versterkingsdoeltreffendheid
Dit het 5'→3' DNA-polimerase-aktiwiteit en 5'→3'-eksonuklease-aktiwiteit, sonder 3'→5'-eksonuklease-aktiwiteit.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Spesifiek-geoptimaliseerde buffer en warmbegin-Taq-ensiem kan nie-spesifieke amplifikasie en primer dimeer vorming voorkom
Hoë sensitiwiteit—kan lae kopieë van sjabloon opspoor
Die stel gebruik 'n unieke Foregene-omgekeerde transkripsie-reagens en Foregene HotStar Taq DNA-polimerase gekombineer met 'n unieke reaksiestelsel om die amplifikasie-doeltreffendheid en spesifisiteit van die reaksie effektief te verbeter.
Postyd: Mei-09-2023
