Die uitstaande kenmerk van die PCR-reaksie is sy groot versterkingskapasiteit en uiters hoë sensitiwiteit.Ten einde PCR prestasie en opsporing doeltreffendheid te verbeter, is ons daartoe verbind om die PCR versterking kapasiteit en opsporing sensitiwiteit te verbeter, maar die hoofpyn is in die proses van die eksperiment.Vals positiewes kom dikwels voor, en 'n baie klein hoeveelheid monsterkruiskontaminasie of PCR-produkkontaminasie kan vals positiewe in die eksperiment veroorsaak.
Vyf tipes PCR produk kontaminasie
Daar is baie redes vir PCR-kontaminasie, wat rofweg in die volgende kategorieë verdeel kan word:
Monsterkontaminasie word hoofsaaklik veroorsaak deur die kontaminasie van die houer vir die versameling van die monster, of wanneer die monster geplaas word, word dit uit die houer gelek as gevolg van los verseëling, of die monster word aan die buitekant van die houer vasgeplak, wat kruisbesmetting veroorsaak;Kontaminasie lei tot kontaminasie tussen monsters;sommige mikrobiese monsters, veral virusse, kan met aërosols versprei of aërosols vorm, wat wedersydse kontaminasie tot gevolg het.
Die hoofrede is dat tydens die voorbereiding van PCR-reagense, die monsterpistool, houer, dubbelgedistilleerde water en ander oplossings deur die PCR-nukleïensuursjabloon gekontamineer word.
In molekulêre biologie laboratoriums en sommige laboratoriums wat gekloonde plasmiede as positiewe kontrole gebruik, is die probleem van gekloonde plasmied kontaminasie ook algemeen.Omdat die inhoud van kloningsplasmied in eenheidsvolume redelik hoog is, en meer gereedskap en reagense nodig is in die suiweringsproses, en die plasmied in lewende selle is baie waarskynlik besmet as gevolg van die sterk groei- en reproduksievermoë van lewende selle.
Die kontaminasie van geamplifiseerde produkte is die mees algemene kontaminasieprobleem in PCR-reaksies.Omdat die kopiehoeveelheid van PCR-produk groot is (gewoonlik 1013 kopieë/ml), wat baie hoër is as die limiet van PCR-opsporingskopiegetal, kan 'n baie klein hoeveelheid PCR-produkkontaminasie vals positiewes veroorsaak.
Aërosolbesoedeling is die mees waarskynlike vorm van kontaminasie van PCR-produkte, en dit is ook die maklikste om oor die hoof gesien te word.Dit word gevorm deur die wrywing tussen die vloeistofoppervlak en die lug.Oor die algemeen kan aërosolbesoedeling gevorm word wanneer die deksel oopgemaak word, wanneer die monster geaspireer word, of selfs wanneer die reaksiebuis kragtig geskud word.Volgens berekeninge kan 'n aërosoldeeltjie 48 000 kopieë bevat, so die besoedeling wat daardeur veroorsaak word, is 'n probleem wat spesiale aandag verdien.
In die besonder, toetslaboratoriums gebruik dikwels dieselfde paar primers om 'n sekere geen te toets.Met verloop van tyd sal 'n groot hoeveelheid PCR-produk kontaminasie in die laboratoriumruimte voorkom.As so 'n besoedeling eers plaasvind, is dit moeilik om dit in 'n kort tyd uit te skakel.
Vir die eerste drie tipes besoedeling kan ons doeltreffende middele gebruik om te vermy, maar die besoedeling wat deur PCR-produkte veroorsaak word, is moeilik om te voorkom, veral in die konstruksie van nie-standaard PCR-laboratoriums.In die PCR-proses, wanneer die pipetpunt die vloeistof suig en blaas, en die PCR-buisdeksel oopgemaak word, sal 'n aërosol gevorm word.Die DNS-molekules wat deur die aërosol gedra word (een aërosol kan tienduisende DNS dra) is moeilik om uit te skakel omdat hulle in die lug dryf.Sodra die volgende rondte PCR-eksperimente bekendgestel is, sal vals positiewes onvermydelik voorkom.
Soos in die figuur hieronder getoon, het die negatiewe beheer ook die ooreenstemmende band van belang versterk:
Die eerste deel van hierdie uitgawe van PCR-besoedeling en voorkoming word hier bekendgestel.Die volgende uitgawe sal vir jou die tweede deel "Voorkoming van PCR-produkkontaminasie" bring, so bly ingeskakel!
Pos tyd: Jul-25-2017
