Ct-waarde is die belangrikste resultaataanbiedingsvorm van fluoresserende kwantitatiewe PCR.Dit word gebruik om geenuitdrukkingsverskille of geenkopiegetal te bereken.So, wat word die Ct-waarde van fluoressensie-kwantifisering as redelik beskou?Hoe om die effektiewe reeks van Ct-waarde te verseker?
Wat is Ct-waarde?
Tydens die qPCR amplifikasie proses, die ooreenstemmende aantal amplifikasie siklusse (Cycle Threshold) wanneer die fluoressensie sein van die versterkte produk die vasgestelde fluoressensie drempel bereik.C staan vir Cycle en T staan vir Threshold.Eenvoudig gestel, die Ct-waarde is die aantal siklusse wat ooreenstem met wanneer die aanvanklike sjabloonversterking 'n sekere hoeveelheid produk in qPCR bereik.Die sogenaamde "'n sekere hoeveelheid produk" sal later verder verduidelik word.
Wat doen die Ct-waarde?
1.Verwantskap tussen eksponensiële versterking, sjabloonbedrag en Ct-waarde
Ideaal gesproke word gene in qPCR opgehoop deur eksponensiële amplifikasie na 'n sekere aantal siklusse.Die verband tussen die aantal versterkingsiklusse en die hoeveelheid produkte is: Versterkte produkhoeveelheid = aanvanklike sjabloonhoeveelheid × (1+En) siklusgetal.Die qPCR-reaksie is egter nie altyd in 'n ideale situasie nie.Wanneer die hoeveelheid versterkte produk 'n "sekere produkhoeveelheid" bereik, is die aantal siklusse op hierdie tydstip die Ct-waarde, en dit is in die eksponensiële versterkingsperiode.Die verhouding tussen die Ct-waarde en die hoeveelheid beginsjabloon: Daar is 'n lineêre verwantskap tussen die Ct-waarde van die sjabloon en die logaritme van die beginkopienommer van die sjabloon.Hoe hoër die aanvanklike sjabloonkonsentrasie, hoe kleiner is die Ct-waarde;hoe laer die aanvanklike sjabloonkonsentrasie, hoe groter is die Ct-waarde.
2.Amplifikasiekurwe, fluoressensiedrempel en sekere PCR-produkhoeveelheid
Die hoeveelheid qPCR-amplifikasieproduk word direk in die vorm van fluoresserende sein aangebied, dit wil sê die amplifikasiekurwe.In die vroeë stadium van PCR is die amplifikasie onder ideale toestande, die aantal siklusse is klein, die produkophoping is klein, en die vlak van fluoressensie kan nie duidelik van die fluoressensie-agtergrond onderskei word nie.Daarna neem die fluoressensie toe en gaan die eksponensiële fase binne.Die hoeveelheid PCR-produk kan op 'n sekere punt waargeneem word wanneer die PCR-reaksie net in die eksponensiële fase is, wat gebruik kan word as "'n sekere hoeveelheid produk", en die aanvanklike inhoud van die sjabloon kan hieruit afgelei word.Daarom is die fluoressensie sein intensiteit wat ooreenstem met 'n sekere hoeveelheid produk die fluoressensie drempel.
In die laat stadium van PKR toon die amplifikasiekromme nie meer eksponensiële amplifikasie nie, en gaan die lineêre fase en platofase binne.
3.Reproduceerbaarheid van Ct-waardes
Wanneer die PCR-siklus die siklusnommer van die Ct-waarde bereik, het dit pas die ware eksponensiële versterkingsperiode binnegegaan.Op hierdie tydstip is die klein fout nie versterk nie, so die reproduceerbaarheid van die Ct-waarde is uitstekend, dit wil sê, dieselfde sjabloon word op verskillende tye of in verskillende buise gelyktydig versterk.Amplifikasie, die verkry Ct-waarde is konstant.
1.Versterking doeltreffendheid En
PCR-amplifikasie-doeltreffendheid verwys na die doeltreffendheid waarmee die polimerase die geen wat geamplifiseer moet word, in 'n amplikon omskakel.Die amplifikasie-doeltreffendheid wanneer een DNA-molekule in twee DNA-molekules omskep word, is 100%.Amplifikasie doeltreffendheid word algemeen uitgedruk as En.Ten einde die ontleding van daaropvolgende artikels te vergemaklik, word die faktore wat die versterkingsdoeltreffendheid beïnvloed kortliks bekendgestel.
| Beïnvloedende faktore | verduideliking | Hoe om te oordeel? |
| A. PCR-inhibeerders | 1. Die sjabloon-DNS bevat stowwe wat die PCR-reaksie inhibeer, soos proteïene of skoonmaakmiddels.2. Die cDNA na omgekeerde transkripsie bevat 'n hoë konsentrasie van templaat-RNA of RT-reagenskomponente, wat ook die daaropvolgende PKR-reaksie kan inhibeer. | 1. Of daar besoedeling is, kan beoordeel word deur die verhouding van A260/A280 en A260/A230 of RNA-elektroforese te meet.2. Of die cDNA volgens 'n sekere verhouding na omgekeerde transkripsie verdun word. |
| B. Onbehoorlike onderlaagontwerp | Primers uitgloei nie doeltreffend nie | Gaan onderlaag na vir onderlaag-dimere of haarnaaldjies, wanpassende en soms strekkende introniese ontwerpe. |
| C. Onbehoorlike PCR-reaksieprogramontwerp | 1. Primers kan nie effektief uitgloei nie2. Onvoldoende vrystelling van DNA-polimerase 3. Langtermyn hoë temperatuur DNA polimerase aktiwiteit het afgeneem | 1. Die uitgloeitemperatuur is hoër as die TM-waarde van die onderlaag2. Voordenatureringstyd is te kort 3. Die tyd van elke stadium van die reaksieprosedure is te lank |
| D. Onvoldoende vermenging van reagense of pipeteringsfoute | In die reaksiestelsel is die plaaslike konsentrasie van PCR-reaksiekomponente te hoog of ongelyk, wat lei tot nie-eksponensiële amplifikasie van PCR-amplifikasie | |
| E. Amplicon Lengte | Die lengte van die amplikon is te lank, oorskry 300bp, en die versterkingsdoeltreffendheid is laag | Kontroleer dat die amplikonlengte tussen 80-300bp is |
| F. Invloed van qPCR-reagense | Die konsentrasie van DNA-polimerase in die reagens is laag of die konsentrasie van ione in die buffer is nie geoptimaliseer nie, wat daartoe lei dat die Taq-ensiemaktiwiteit nie die maksimum bereik nie | Bepaling van versterkingsdoeltreffendheid deur standaardkurwe |
2.Omvang van Ct-waardes
Ct-waardes wissel van 15-35.As die Ct-waarde minder as 15 is, word dit beskou dat die amplifikasie binne die omvang van die basislynperiode is en dat die fluoressensiedrempel nie bereik is nie.Ideaal gesproke is daar 'n lineêre verband tussen die Ct-waarde en die logaritme van die aanvanklike kopienommer van die sjabloon, dit wil sê die standaardkromme.Deur die standaardkurwe, wanneer die amplifikasie-doeltreffendheid 100% is, is die berekende Ct-waarde vir die kwantifisering van die enkelkopiegetal van die geen rondom 35. As dit groter as 35 is, is die aanvanklike kopiegetal van die sjabloon teoreties minder as 1, wat as betekenisloos beskou kan word.
Vir verskillende geen Ct-reekse, as gevolg van die verskil in geenkopiegetal en amplifikasiedoeltreffendheid in die aanvanklike sjabloonhoeveelheid, is dit nodig om 'n standaardkromme vir die geen te maak en die lineêre opsporingsreeks van die geen te bereken.
3. Beïnvloedende faktore van Ct-waarde
Uit die verband tussen die aantal amplifikasiesiklusse en die hoeveelheid produk: hoeveelheid versterkte produk = hoeveelheid aanvanklike sjabloon × (1+En) siklusgetal, kan gesien word dat onder ideale toestande, die hoeveelheid aanvanklike sjabloon en En 'n negatiewe impak op Ct-waarde sal hê, beïnvloed word.Die verskil in sjabloonkwaliteit of versterkingsdoeltreffendheid sal veroorsaak dat die Ct-waarde te groot of te klein is.
4.Ct-waarde is te groot of te klein
Postyd: 22-2-2023
