PCR is die mees gebruikte nukleïensuurversterkingstegnologie en word wyd gebruik as gevolg van die sensitiwiteit en spesifisiteit daarvan.PCR vereis egter herhaalde termiese denaturering en kan nie ontslae raak van die beperkings van staatmaak op instrumente en toerusting nie, wat die toepassing daarvan in kliniese veldtoetsing beperk.
Sedert die vroeë 1990's het baie laboratoriums begin om konstante temperatuurversterkingstegnologie te ontwikkel wat nie termiese denaturering benodig nie.Nou het hulle lus-gemedieerde isotermiese amplifikasie tegnologie, string vervanging isotermiese amplifikasie tegnologie, rollende sirkel isotermiese amplifikasie tegnologie, en nukleïensuur volgorde afhanklikheid ontwikkel.Isotermiese versterkingstegnologie en ander tegnologieë.
Loop-gemedieerde isotermiese versterking
Die amplifikasiebeginsel is gebaseer op die feit dat DNS in 'n dinamiese ewewigstoestand by ongeveer 65°C is.Wanneer enige primer basisgepaard is en uitgebrei word na die komplementêre deel van dubbelstring-DNS, sal die ander string dissosieer en enkelstrengs word.
By hierdie temperatuur gebruik DNA 4 spesifieke primers om op 'n string-verplasing DNA-polimerase staat te maak om die sintese van string-verplasing DNA voortdurend self te laat sirkuleer.
Bepaal eers die 6 spesifieke streke F3, F2, F1, B1, B2, B3 op die teikengeen, en ontwerp dan 4 primers gebaseer op hierdie 6 spesifieke streke (soos getoon in die figuur hieronder):
Die voorste binneste primer (FIP) is saamgestel uit F1c en F2.
Die agterwaartse binne-onderlaag (BIP) is saamgestel uit B1c en B2, en TTTT word as 'n spasieerder in die middel gebruik.
Die buitenste primers F3 en B3 is onderskeidelik saamgestel uit F3- en B3-streke op die teikengeen.
In die LAMP-reaksiestelsel is die konsentrasie van die binneste primer 'n paar keer dié van die buitenste primer.Die binneste primer word eers met die sjabloonstring gekombineer om 'n komplementêre string te sintetiseer om 'n DNA-dubbelstring te vorm.Vervolgens word die buitenste primer met die sjabloonstring gekombineer om 'n DNS-dubbelstring te vorm.Onder die werking van BstDNA-polimerase word die komplementêre string wat deur die binneste primer gesintetiseer word, vrygestel.Na 'n reeks reaksies vorm die komplementêre string uiteindelik 'n enkele DNS-string met 'n halterstruktuur.
Die halterstruktuur DNA-enkelstring self word as 'n sjabloon gebruik om voortdurend 'n oorgangsstam-lusstruktuur DNA met 'n oop einde te vorm.Die binne- en buitenste primers lei die oorgangsstam-lusstruktuur DNA om voortdurend string verplasing en verlengingsreaksies te ondergaan, en uiteindelik veelvuldige stam-lus strukture met verskillende lengtes te vorm.DNA mengsel.
Voor- en nadele van lus-bemiddelde isotermiese versterking
Voordele van LAMP:
(1) Hoë amplifikasie doeltreffendheid, wat effektief 1-10 kopieë van die teiken geen binne 1 uur kan amplifiseer, en die amplifikasie doeltreffendheid is 10-100 keer dié van gewone PCR.
(2) Die reaksietyd is kort, die spesifisiteit is sterk, en geen spesiale toerusting word benodig nie.
Tekortkominge van LAMP:
(1) Die vereistes vir onderlaag is besonder hoog.
(2) Die geamplifiseerde produk kan nie vir kloning en volgordebepaling gebruik word nie, maar kan slegs vir oordeel gebruik word.
(3) As gevolg van sy sterk sensitiwiteit, is dit maklik om aërosols te vorm, wat vals positiewes veroorsaak en die toetsresultate beïnvloed.
STandverplasing versterking
Strandverplasing-amplifikasie (SDA) is 'n in vitro isotermiese DNA-amplifikasietegniek gebaseer op ensiematiese reaksie wat die eerste keer deur die Amerikaanse geleerde Walker in 1992 voorgestel is.
Die basiese stelsel van SDA sluit 'n beperking-endonuklease, 'n DNA-polimerase met stringverplasingsaktiwiteit, twee pare primers, dNTP's en kalsium- en magnesiumione en bufferstelsels in.
Die beginsel van string verplasing amplifikasie is gebaseer op die chemies gemodifiseerde beperking endonuklease herkenningsvolgorde aan beide kante van die teiken DNA.Die endonuklease maak die gaping in die string-DNA oop by sy herkenningsplek, en die DNA-polimerase verleng die gaping 3′ End en vervang die volgende DNA-string.
Die vervangde enkelstringe DNA kan gekombineer word met primers en deur DNA-polimerase tot dubbelstringe uitgebrei word.Hierdie proses word voortdurend herhaal, sodat die teikenvolgorde doeltreffend geamplifiseer word.
Voor- en nadele van strengverplasingsversterkingstegnologie
Voordele van SDA:
Die versterkingsdoeltreffendheid is hoog, die reaksietyd is kort, die spesifisiteit is sterk, en geen spesiale toerusting word benodig nie.
Tekortkominge van SDA:
Die produkte is nie eenvormig nie, en sommige enkel- en dubbelstrengs produkte word altyd in die SDA-siklus geproduseer, en stert sal onvermydelik voorkom wanneer dit deur elektroforese opgespoor word.
Rolling sirkel versterking
Rollende sirkelversterking (RCA) word voorgestel deur gebruik te maak van die metode om DNA van patogeniese organismes deur middel van rolsirkel te kopieer.Dit verwys na die gebruik van enkelstring-sirkulêre DNA as 'n sjabloon by 'n konstante temperatuur, en 'n spesiale DNA-polimerase (soos Phi29) ) Onder die werking van rollende sirkel-DNS-sintese om die amplifikasie van die teikengeen te bereik.
RCA kan verdeel word in lineêre versterking en eksponensiële versterking.Die doeltreffendheid van lineêre RCA kan 10 bereik5keer, en die doeltreffendheid van eksponensiële RCA kan 10 bereik9tye.
Eenvoudige onderskeid, soos getoon in die figuur hieronder, gebruik lineêre amplifikasie a slegs 1 primer, eksponensiële amplifikasie b het 2 primers.
Lineêre RCA word ook enkel primer RCA genoem.'n Primer bind aan sirkelvormige DNA en word verleng deur die werking van DNA-polimerase.Die produk is 'n lineêre enkelstring met 'n groot aantal herhalende rye duisende maal die lengte van 'n enkele lus.
Aangesien die produk van lineêre RCA altyd aan die begin-primer gekoppel is, is die maklike fiksasie van die sein 'n groot voordeel.
Eksponensiële RCA, ook bekend as Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), in eksponensiële RCA, een primer versterk die RCA produk, die tweede primer hibridiseer met die RCA produk en strek, en die vervanging is reeds gebind aan die RCA produk Die downstream primers verleng die string, en herhaal verlenging en vervanging om 'n dendritiese produk te produseer.
Die voordele en nadele van rollende sirkel nukleïensuurversterking
Voordele van RCA:
Hoë sensitiwiteit, goeie spesifisiteit en maklike werking.
Tekortkominge van RCA:
Agtergrondprobleme tydens seinopsporing.Tydens die RCA-reaksie kan die ongesirkuleerde hangslotsonde en die sjabloon-DNA of RNA van die ongebonde sonde sommige agtergrondseine genereer.
Nukleïensuurvolgorde-gebaseerde amplifikasie
Nukleïensuurvolgorde-gebaseerde amplifikasie (NASBA) is 'n nuwe tegnologie wat op die basis van PCR ontwikkel is.Dit is 'n deurlopende en isotermiese nukleïensuuramplifikasie wat gelei word deur 'n paar primers met 'n T7-promotorvolgorde.Die tegnologie kan die templaat-RNA met ongeveer 109 keer in ongeveer 2 uur versterk, wat 1000 keer hoër is as die konvensionele PCR-metode en nie spesiale toerusting benodig nie.
Hierdie tegnologie is gebruik vir vinnige diagnose van siektes sodra dit verskyn het, en baie maatskappye gebruik tans hierdie metode in RNA-opsporingstelle.
Alhoewel RNA-amplifikasie ook omgekeerde transkripsie-PKR-tegnologie kan gebruik, het NASBA sy eie voordele: dit kan onder relatief konstante temperatuurtoestande uitgevoer word, en dit is meer stabiel en akkuraat as tradisionele PKR-tegnologie.
Die reaksie is by 41 grade Celsius en vereis AMV (aviair myeloblastosis virus) omgekeerde transkriptase, RNase H, T7 RNA polimerase en 'n paar primers om te voltooi.
Die proses sluit hoofsaaklik in:
Die voorwaartse primer bevat die komplementêre volgorde van die T7-promotor.Tydens die reaksie bind die voorwaartse primer aan die RNA-string en word deur die AMV-ensiem gekataliseer om 'n DNA-RNA-dubbelstring te vorm.
RNase H verteer die RNA in die baster-dubbelstring en behou die enkelstring-DNS.
Onder die werking van die omgekeerde primer en die AMV-ensiem word 'n DNA-dubbelstring wat die T7-promotorvolgorde bevat, gevorm.
Onder die werking van T7 RNA-polimerase word die transkripsieproses voltooi en 'n groot hoeveelheid teiken-RNA word geproduseer.
Voordele van NASBA:
(1) Die primer het 'n T7-promotorvolgorde, maar die vreemde dubbelstring-DNS het geen T7-promotorvolgorde nie en kan nie geamplifiseer word nie, dus het hierdie tegnologie hoë spesifisiteit en sensitiwiteit.
(2) NASBA inkorporeer die omgekeerde transkripsieproses direk in die amplifikasiereaksie, wat die reaksietyd verkort.
Nadele van NASBA:
(1) Die reaksiekomponente is meer ingewikkeld.
(2) Drie soorte ensieme word benodig om die reaksiekoste hoër te maak.
Postyd: Aug-06-2021
