PCR, veelvuldig PCR, In situ PCR, Omgekeerde PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Ons sal die konsepte, stappe en besonderhede van verskeie PCR uitsorteer

Ⅰ. PCR

Polimerase kettingreaksie, waarna verwys word as PCR, is 'n molekulêre biologiese tegnologie wat gebruik word om spesifieke DNS-fragmente te vergroot.Dit kan as 'n spesiale DNA-replikasie in vitro beskou word.DNA-polimerase (DNA Polimerase I) is so vroeg as 1955 ontdek, en Klenow Fragment of E. Coli, wat eksperimentele waarde en bruikbaarheid het, is in die vroeë 1970's deur Dr H. Klenow ontdek, maar omdat hierdie ensiem nie temperatuur verdra nie, kan hoë temperatuur dit degenereer, dus voldoen dit nie aan die polimerase-degenerasiereaksie nie.Die ensieme wat vandag gebruik word (genoem Taq-polimerase), is geïsoleer uit Thermus aquaticus, 'n warmbronbakterie in 1976. Die kenmerk daarvan is dat dit hoë temperature kan weerstaan ​​en 'n ideale ensiem is, maar dit word wyd gebruik na die 1980's.Die oorspronklike konsep van die oorspronklike primitiewe prototipe van PCR is soortgelyk aan geenherstel en kopiëring, wat deur Dr KJell Kleppe in 1971 voorgestel is. Hy het die eerste eenvoudige en korttermyn geenkopie gepubliseer (soortgelyk aan die eerste twee siklusreaksies van PCR).Die PCR wat vandag ontwikkel is, is ontwikkel deur Dr. Kary B. Mullis in 1983. Dr. Mullis het daardie jaar PE-maatskappye bedien, so PE het 'n spesiale status in die PCR-industrie.Dr Mullis het amptelik die eerste verwante referaat saam met Saiki en ander in 1985 gepubliseer. Sedertdien is die gebruik van PCR duisende kilometers per dag, en daar kan gesê word dat die kwaliteit van verwante referate baie ander navorsingsmetodes onsmaaklik maak.Gevolglik word PCR-tegnologie wyd gebruik in biologiese wetenskaplike navorsing en kliniese toepassings, wat die belangrikste tegnologie van molekulêre biologie-navorsing word.Mullis het ook die 1993 Nobelprys in Chemie gewen.

PCRBeginsel

Die basiese beginsel van PCR-tegnologie is soortgelyk aan die natuurlike replikasieproses van DNA, en die spesifisiteit daarvan hang af van die oligonukleotied-primer wat komplementêr is tot beide kante van die teikenvolgorde.PCR is saamgestel uit degenerasie-gloeiing-verlengende drie basiese reaksiestappe: ①Degenerasie van sjabloon-DNA: Nadat die sjabloon-DNA verhit is tot ongeveer 93°C vir 'n sekere tydperk, maak die dubbele-DNA-oplossing vir die dubbelketting-DNS wat gevorm word deur die PCR-amplifikasie van die sjabloon-DNA Leaving, dit 'n enkele ketting met die primer-reaksie voor te berei sodat dit gekombineer kan word vir die primer-reaksie.②Die uitgloeiing (verbinding) van die sjabloon-DNA en die onderlaag: Nadat die sjabloon-DNA verhit is en in 'n enkele ketting gedegenereer is, daal die temperatuur tot ongeveer 55°C.Die komplementêre volgorde van die primer en die sjabloon DNA enkelketting.③Die uitbreiding van die primer: DNA-sjabloon-die primer-binding is gebaseer op die werking van TaqDNA-polimerase, met dNTP as die reaksie-roumateriaal.Behou die beginsel van replikasie, sintetiseer 'n nuwe semi-gereserveerde kopieketting wat die sjabloon DNA-ketting komplementeer, en herhaal siklus degenerasie-gloei-verlenging drie prosesse kan meer "semi-gereserveerde kopie ketting" kry, en hierdie nuwe ketting is weer beskikbaar Word 'n sjabloon vir die volgende siklus.Dit neem 2-4min om die lus te voltooi, die teikengeen kan 'n paar miljoen keer in 2-3 uur geamplifiseer word.

StandaardPCRReaksiestelsel

Vyf elemente van PCR-reaksie

Daar is hoofsaaklik vyf soorte stowwe betrokke by PCR-reaksie, naamlik primer, ensiem, dNTP, templaat en buffer (Mg2+ word vereis).[PCR-prosedure]

Die standaard PKR-proses word in drie stappe verdeel

1. DNA-degenerasie (90°C-96°C): Dubbelketting-DNS-sjablone onder termiese werking, waterstofbindings breek en vorm 'n enkelketting-DNS.

2. Uitgloeiing (25℃ -65℃): Die stelseltemperatuur word verlaag, die onderlaag word met die DNA-sjabloon gekombineer om 'n plaaslike dubbelketting te vorm.

3. Uitbreiding (70℃ -75℃): Onder die werking van Taq-ensiem (ongeveer 72°C, die beste aktiwiteit), word dNTP as die grondstof gebruik, strek vanaf die 5′-punt van die primer → 3′-kant, sintese en templaat komplementeer mekaar DNA-ketting.

Elke siklus word gedenatureer, uitgegloei en verleng, wat die DNS-inhoud verdubbel.Op die oomblik, as gevolg van die kort amplifikasie area, kan sommige PCR in 'n baie kort tyd herhaal word selfs al is die Taq ensiem aktiwiteit nie optimaal nie, dus kan dit na twee stappe verander word, dit wil sê, die uitgloeiing en verlenging kan op dieselfde tyd by 60°C-65°C uitgevoer word.Om die proses van opheffing en afkoeling te verminder en die reaksiespoed te verbeter.

PCR Reaksie kenmerke

● Hoë-spesifisiteit

Die spesifieke deurslaggewende faktore van die PKR-reaksie is: ①Die spesifieke kombinasie van die primer en die templaat-DNS.②Die beginsel van basisparing.③ Die lojaliteit van die TaqDNA polimerase sintesereaksie.④Die spesifisiteit en konserwatiefheid van die teikengeen.

Die korrekte kombinasie van primers en sjablone is die sleutel.Die binding van die onderlaag en die sjabloon en die verlenging van die onderlaagketting is gebaseer op die beginsel van alkaliese basispassing.Die lojaliteit van polimerase sintese reaksies en die hoë temperatuur weerstand van die Taq DNA polimerase om die binding (verbinding) van die sjabloon en primer in die reaksie te maak, kan by 'n hoër temperatuur uitgevoer word.Die spesifisiteit van die kombinasie word aansienlik verhoog.Die snit kan 'n hoë mate van korrektheid handhaaf.Deur 'n teikengenetiese streek met hoë konserwatiefheid en hoë konserwatiefheid te kies, is sy spesifisiteit hoër.

● Hoë sensitiwiteit

Die produksievolume van PCR-produkte word met indeks verhoog, wat die beginsjabloon van Picker (PG=10-12) kan uitbrei om die vlak van mikrobeheerder tot die vlak van mikrogram (μg= -6) te verhoog.'n Teikenselle kan van 1 miljoen selle opgespoor word;in die opsporing van virusse kan die sensitiwiteit van PCR 3 RFU's bereik (leë kolle gevorm eenhede);die minimum opsporingsyfer in bakteriese wetenskap is 3 bakterieë.

● Eenvoudig en vinnig

Die PCR-refleksie gebruik 'n hoë-temperatuur Taq DNA-polimerase, wat die reaksie-oplossing op een slag byvoeg, dit wil sê 'n degenerasie-gloei-verlengingsreaksie op die DNA-amplifikasie-oplossing en waterbadpot.Oor die algemeen word die amplifikasiereaksie binne 2 tot 4 uur voltooi.Aangevulde produkte word oor die algemeen deur elektriese swaard ontleed, en hoef nie isotope te gebruik nie, geen radioaktiewe besoedeling nie en maklike bevordering.

● Die suiwerheid van die monster is laag

Dit is nie nodig om virusse of bakterieë en kweekselle te skei nie.DNS-ruprodukte en RNA kan as versterkers gebruik word.DNS-amplifikasie-opsporing kan direk gebruik word deur kliniese monsters soos bloed, liggaamsvloeistof, hoeswasvloeistof, hare, selle en lewende weefsel te gebruik.

PCRalgemene probleme

● Vals negatief, geen versterkte bande nie

Die sleutelstadia van die PCR-reaksie sluit in: ① voorbereiding van templaat-nukleinsure, ② kwaliteit en spesifisiteit van primers, ③ die kwaliteit van ensieme ④ PCR-siklustoestande.Om die rede te vind, moet ook ontleed en bestudeer word vir die bogenoemde skakels.

Sjablone: ​​① Die sjabloon bevat diverse proteïene, ② Die sjabloon bevat 'n Taq-ensiem-inhibeerder, ③ Die proteïen in die sjabloon word nie uitgeskakel nie, veral die groepproteïen in die chromosoom.⑤ Deminer nukleïensuur degenerasie is nie deeglik nie.Wanneer die kwaliteit van ensieme en primers goed is, is daar geen amplifikasieband nie, wat heel waarskynlik die spysverteringsbehandeling van monsters is.Daar is iets fout met die sjabloonnukleïensuur-ekstraksieproses, so om 'n effektiewe en stabiele verteringoplossing voor te berei, moet die prosedure daarvan reggestel word en nie arbitrêr verander word nie.

Ensiem-inaktivering: 'n nuwe ensiem of beide ou en nuwe ensieme moet saam gebruik word om te ontleed of die ensiemaktiwiteit verlore is of onvoldoende is, wat lei tot vals negatiewe.Daar moet kennis geneem word dat Taq-ensiem of etidiumbromied soms vergeet word.

Onderlaag: die kwaliteit van die onderlaag, die konsentrasie van die onderlaag, en of die konsentrasie van die twee onderlaag simmetries is.Dit is 'n algemene rede vir die PCR-mislukking of die toenemende band is nie ideaal nie en geneig om te diffundeer.Daar is probleme met die kwaliteit van die primers van sommige bondelnommers.Die twee primers het 'n hoë konsentrasie en 'n lae konsentrasie, wat lae-doeltreffendheid asimmetriese amplifikasie veroorsaak.Die teenmaatreëls is: ① Kies 'n goeie onderlaag om eenhede te sintetiseer.② Die konsentrasie van die primer hang nie net af van die OD-waarde nie, maar gee ook aandag aan die primer se oorspronklike vloeistof om agar-suikergelelektroforese te maak.Daar moet 'n onderlaagstrooksone wees, en die helderheid van die twee onderlaag moet oor die algemeen konsekwent wees.Band, PCR kan in hierdie tyd misluk, en dit moet opgelos word met die primer sintese-eenheid.As 'n onderlaag hoog is, is die helderheid laag, en sy konsentrasie moet gebalanseer word wanneer dit verdun word.③ Die onderlaag moet betaal word en teen 'n hoë konsentrasie gestoor word om veelvuldige vries of langtermyn verkoelingsdele van die yskas te voorkom, wat sal veroorsaak dat die onderlaag versleg en afbreek.④ Die ontwerp van die primer is onredelik, soos die lengte van die primer is onvoldoende, en die di cluster word tussen die primers gevorm.

Mg2+konsentrasie: Mg2+ioonkonsentrasie het 'n groot impak op PCR amplifikasie doeltreffendheid.Oormatige konsentrasie kan die teenoorgestelde geslag van PCR-amplifikasie verminder.As die konsentrasie te laag is, sal die PCR-versterking-uitset selfs die PCR-versterking misluk sonder die uitbreidingsband.

Verandering van reaksievolume: Die volume wat in PCR-amplifikasie gebruik word, is 20ul, 30ul, en 50ul of 100uL, die groot volume van die aansoek vir PCR-amplifikasie word ingestel volgens verskillende doeleindes van wetenskaplike navorsing en kliniese toetsing.Nadat u klein volumes soos 20ul gemaak het, is dit nodig om 'n koordtoestand te maak wanneer u die grootte maak, anders sal dit misluk.

Fisiese redes: Transformasie is baie belangrik vir PCR-amplifikasie.As die degenerasietemperatuur laag is, is die degenerasietyd kort, dit sal waarskynlik in vals negatiewe voorkom;te lae uitgloeiingstemperatuur kan nie-spesifieke amplifikasie veroorsaak en spesifieke versterkingsdoeltreffendheid verminder.Beïnvloed die kombinasie van primers en sjablone hoogs om PCR amplifikasie doeltreffendheid te verminder.Soms is dit nodig om standaard termometers te gebruik om die veranderlikheid, uitgloeiing en verlengde temperatuur in die verlenging of wateroplosbare kookplaat op te spoor, wat een van die redes is vir die mislukking van die PCR.

Teikenvolgordevariante: Indien die teikenvolgorde voorkom, 'n mutasie of delesie, word die kombinasie van die prototipe en die sjabloon gekombineer, of as gevolg van die gebrek aan 'n teikenvolgorde, sal die primer en die sjabloon die komplementêre volgorde verloor, en die PCR-amplifikasie daarvan sal nie suksesvol wees nie.

● Vals positief

Die PCR-amplifikasieband lyk in ooreenstemming met die teikenvolgordeband, en soms is sy band netjieser en hoër.

Primer-ontwerp is nie toepaslik nie: die geselekteerde amplifikasievolgorde en nie-doel amplifikasie volgorde het homoloë, dus wanneer PCR amplifikasie, is die geamplifiseerde PCR produkte nie-doelgerigte volgordes.Die teikenvolgorde is te kort of die primer is te kort, en dit is geneig tot vals positief.Moet herontwerp word.

Kruisbesoedeling van teikenvolgorde of amplifikasieprodukte: Daar is twee redes vir hierdie besoedeling: Eerstens, kruisbesoedeling van die hele genoom of groot segmente, wat lei tot vals positiewe.Hierdie soort vals positiewe kan deur die volgende metodes opgelos word: Wees versigtig en sagkens tydens werking om te verhoed dat die teikenvolgorde in die monsterpistool ingeasem word of uit die sentrifugale buis spat.Behalwe vir ensieme en stowwe wat nie hoë temperature kan weerstaan ​​nie, moet alle reagense of toerusting met hoë druk ontsmet word.Die sentrifugale pype en monsters moet op een slag gebruik word.Wanneer nodig, voordat monsters bygevoeg word, word die reaksiebuis en reagens aan ultravioletstrale blootgestel om die bestaande nukleïensuur te vernietig.Tweedens, klein fragmente in die lugbesoedeling.Hierdie klein fragmente is korter as die teikenvolgorde, maar hulle het sekere homologie.Dit kan met mekaar verbind word.Nadat die primers aangevul is, kan die PCR-produk uitgebrei word, wat vals positiewe produksie sal veroorsaak.Dit kan gebruik word om die nes-PKR-metode te verminder of uit te skakel.

● Verskyn nie-spesifieke versterkingsband

Die bande wat na PCR-amplifikasie verskyn het, stem nie ooreen met die verwagte grootte nie, of groot of klein, of terselfdertyd, of terselfdertyd, spesifieke amplifikasiebande en nie-spesifieke amplifikasiebande.Die opkoms van nie-spesifieke bande is: Eerstens is die primers onvolledig komplementêr tot die teikenvolgorde, of die polimerisasie van die primer om 'n di cluster te vorm.Die tweede is dat die konsentrasie van MG2+-ione te hoog is, die uitgloeitemperatuur te laag is, en die aantal PCR-siklusse is verwant.Tweedens, die kwaliteit en hoeveelheid ensieme.Dikwels is ensieme van sommige bronne geneig tot nie-spesiale bande en die ensieme van die ander bron kom nie voor nie.Soms vind nie-spesifieke amplifikasie van ensieme ook plaas.Die teenmaatreëls is: herontwerpte aantreklikhede indien nodig.Verminder die hoeveelheid ensiem of vervang die ensiem van 'n ander bron.Verminder die hoeveelheid primêre, verhoog die hoeveelheid sjablone gepas, en verminder die aantal siklusse.Verhoog die uitgloeitemperatuur behoorlik of gebruik die tweetemperatuurpuntmetode (93°C degenerasie, uitgloeiing en verlenging teen ongeveer 65°C).

● Verskyn afskilferige sleep of smeerband

PKR-versterking blyk soms toegepas of uitgedop of matagtige band te wees.Om die rede, as gevolg van die oormatige hoeveelheid ensieme of die swak kwaliteit van die ensiem, is die dNTP-konsentrasie te hoog, die Mg2+-konsentrasie is te hoog, die uitgloeiingstemperatuur te laag en die aantal siklusse is te veel.Die teenmaatreëls is: ①Verminder die hoeveelheid ensieme, of verander die ensiem van 'n ander bron.②Verminder die konsentrasie van dNTP ③Verminder Mg2+ konsentrasie behoorlik.④Verhoog die hoeveelheid sjablone en verminder die aantal siklusse.

Verwante Produkte

PCR Heroᵀᴹ (Met kleurstof)

◮ Hoër getrouheid: 6 keer dié van gewone Taq-ensiem;

◮ Vinniger versterkingspoed

◮ Meer sjabloonaanpasbaarheid

◮ Hoër versterkingsdoeltreffendheid

◮ Omgewingsverdraagsaamheid is sterker: geplaas by 37°C vir 'n week, wat meer as 90% aktiwiteit handhaaf;

◮ Dit het 5'→3' DNA-polimerase-aktiwiteit en 5'→3'-eksonuklease-aktiwiteit, sonder 3'→5'-eksonuklease-aktiwiteit.

PCR Easyᵀᴹ (Met kleurstof)

Die unieke reaksiestelsel en hoë-doeltreffendheid Taq DNA Polimerase maak dat die PCR reaksie hoër amplifikasie doeltreffendheid, spesifisiteit en sensitiwiteit het.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Een Stap)-SYBR Groen I

◮ Eenstap-stel maak omgekeerde transkripsie en qPCR twee reaksies in dieselfde buis, hoef slegs sjabloon-RNA, spesifieke PCR-primers en RNase-vrye ddH by te voeg₂O.

◮ Die stel kan virale RNA vinnig en doeltreffend kwantitatief analiseer of RNA spoor.

◮ Die stel gebruik 'n unieke Foregene-omgekeerde transkripsie-reagens en Foregene HotStar Taq DNA Polimerase gekombineer met 'n unieke reaksiestelsel om die amplifikasie-doeltreffendheid en spesifisiteit van die reaksie effektief te verbeter.

◮ Die geoptimaliseerde reaksiestelsel maak dat die reaksie 'n hoër deteksie sensitiwiteit, sterker termiese stabiliteit en beter verdraagsaamheid het.

◮ RT-qPCR Maklik^TM(One Step)-SYBR Green I kit kom met ROX interne verwysingskleurstof, wat gebruik kan word om seinagtergrond en seinfoute tussen putte uit te skakel, wat gerieflik is vir kliënte om in verskillende modelle van kwantitatiewe PCR-instrumente te gebruik.

RT Maklik^TMII (Meester Premix vir eerste-string cDNA sintese virReal Time PCR)

-Doeltreffende vermoë om gDNA te verwyder, wat gDNA binne 2 minute in die sjabloon kan verwyder.

-Doeltreffende omgekeerde transkripsiestelsel, dit neem slegs 15 minute om die sintese van die eerste string cDNA te voltooi.

-Komplekse sjablone: ​​sjablone met 'n hoë GC-inhoud en komplekse sekondêre struktuur kan ook met 'n hoë doeltreffendheid omgekeer word.

-Hoë-sensitiwiteit omgekeerde transkripsie stelsel, pg-vlak sjablone kan ook hoë kwaliteit cDNA kry.

-Die omgekeerde transkripsiestelsel het hoë termiese stabiliteit, die optimale reaksietemperatuur is 42℃, en dit het steeds goeie omgekeerde transkripsieprestasie by 50℃.