PCR (polimerase kettingreaksie) is een van die in-vitro DNA amplifikasie tegnologieë, met 'n geskiedenis van meer as 30 jaar.

PKR-tegnologie is in 1983 deur Kary Mullis van Cetus, VSA, begin. Mullis het in 1985 om 'n PCR-patent aansoek gedoen en die eerste PCR-akademiese referaat oor Wetenskap in dieselfde jaar gepubliseer.Mullis is in 1993 met die Nobelprys in chemie vir sy werk bekroon.

Basiese Beginsels van PCR

PCR kan teiken-DNA-fragmente met meer as een miljoen keer versterk.Die beginsel is onder die katalise van DNA-polimerase, met die gebruik van ouerstreng DNA as 'n templaat en spesifieke primer as die beginpunt vir verlenging.Dit word in vitro herhaal deur stappe soos denaturering, uitgloeiing en verlenging.Die proses van dogterstring-DNA komplementêr tot die ouerstring-sjabloon-DNA.

Die standaard PCR-proses word in drie stappe verdeel:

1.Denaturering: Gebruik hoë temperatuur om DNA-dubbelstringe te skei.Die waterstofbinding tussen DNA-dubbelstringe word by hoë temperatuur (93-98℃) verbreek.

2. Uitgloeiing: Nadat die dubbelstring DNA geskei is, verlaag die temperatuur sodat die primer aan die enkelstring DNA kan bind.

3.Verlenging: Die DNS-polimerase begin komplementêre stringe langs die DNS-stringe te sintetiseer vanaf die primers wat gebind word wanneer die temperatuur verlaag word.Wanneer die uitbreiding voltooi is, word 'n siklus voltooi, en die aantal DNA-fragmente verdubbel

Deur hierdie drie stappe 25-35 keer te herhaal, sal die aantal DNA-fragmente eksponensieel toeneem.

Die vernuf van PCR is dat verskillende primers vir verskillende teikengene ontwerp kan word, sodat teikengeenfragmente in 'n kort tydperk geamplifiseer kan word.

Tot dusver kan PCR in drie kategorieë verdeel word, naamlik gewone PCR, fluoresserende kwantitatiewe PCR en digitale PCR.

Die eerste generasie van gewone PCR

Gebruik 'n gewone PCR amplifikasie instrument om die teiken geen te amplifiseer, en gebruik dan agarose gel elektroforese om die produk op te spoor, slegs kwalitatiewe analise kan gedoen word.

Die belangrikste nadele van die eerste generasie PCR:

1. Geneig tot nie-spesifieke amplifikasie en vals positiewe resultate.

2.Die opsporing neem lank en die operasie is omslagtig.

3.Slegs kwalitatiewe toets kan gedoen word

Tweede generasie Real-Time PCR

Real-Time PCR, ook bekend as qPCR, gebruik fluoresserende probes wat die vordering van die reaksiestelsel kan aandui, en monitor die ophoping van versterkte produkte deur die ophoping van fluoresserende seine, en beoordeel die resultate deur die fluoressensiekurwe.Dit kan gekwantifiseer word met behulp van Cq-waarde en standaardkurwe.

Omdat die qPCR-tegnologie in 'n geslote sisteem uitgevoer word, word die waarskynlikheid van kontaminasie verminder, en die fluoressensiesein kan gemonitor word vir kwantitatiewe opsporing, dus is dit die algemeenste in die kliniese praktyk en het die dominante tegnologie in PCR geword.

Die fluoresserende stowwe wat in intydse fluoresserende kwantitatiewe PCR gebruik word, kan verdeel word in: TaqMan fluoresserende sonde, molekulêre bakens en fluoresserende kleurstof.

1) TaqMan fluoresserende sonde:

Tydens PCR-amplifikasie word 'n spesifieke fluoresserende sonde bygevoeg terwyl 'n primerpaar bygevoeg word.Die sonde is 'n oligonukleotied, en albei punte is gemerk met 'n verslaggewer fluoresserende groep en 'n blus fluoresserende groep.

Wanneer die sonde ongeskonde is, word die fluoresserende sein wat deur die verslaggewergroep uitgestraal word deur die blusgroep geabsorbeer;tydens PCR-amplifikasie, klief en degradeer die 5'-3'-eksonuklease-aktiwiteit van Taq-ensiem die sonde, wat die verslaggewer fluoresserende groep en uitdoof maak. Die fluoresserende groep word geskei, sodat die fluoressensie-moniteringstelsel die fluoressensie-sein kan ontvang, dit wil sê elke keer as 'n DNA-string gefluoreer word, gefluoreer word en die fluorescerende string opgehoop word. cence sein is heeltemal gesinchroniseer met die vorming van die PCR-produk.

2) SYBR fluoresserende kleurstof:

In die PCR-reaksiesisteem word 'n oormaat SYBR fluoresserende kleurstof bygevoeg.Nadat die SYBR-fluoresserende kleurstof nie-spesifiek in die DNA-dubbelstring geïnkorporeer is, gee dit 'n fluoresserende sein uit.Die SYBR-kleurstofmolekule wat nie in die ketting geïnkorporeer is nie, sal geen fluoresserende sein uitstraal nie, waardeur die fluoresserende sein verseker word. Die toename in PCR produkte is heeltemal gesinchroniseer met die toename in PCR produkte.SYBR bind slegs aan dubbelstring-DNS, dus kan die smeltkurwe gebruik word om te bepaal of die PKR-reaksie spesifiek is.

3) Molekulêre baken:

Dit is 'n stam-lus dubbel-gemerkte oligonukleotied sonde wat 'n haarnaaldstruktuur van ongeveer 8 basisse aan die 5 en 3 punte vorm.Die nukleïensuurvolgordes aan beide kante is komplementêr gepaard, wat veroorsaak dat die fluoresserende groep en die blusgroep styf is.Naby, geen fluoressensie sal geproduseer word nie.

Nadat die PCR-produk gegenereer is, tydens die uitgloeiingsproses, word die middelste deel van die molekulêre baken met 'n spesifieke DNS-volgorde gepaar, en die fluoresserende geen word van die uitblusgeen geskei om fluoressensie te produseer.

Die belangrikste nadele van tweede generasie PCR:

Sensitiwiteit ontbreek steeds, en die opsporing van monsters met 'n lae kopie is onakkuraat.

Daar is die invloed van die agtergrondwaarde, en die resultaat is vatbaar vir inmenging.

Wanneer daar PCR-inhibeerders in die reaksiestelsel is, is die opsporingsresultate vatbaar vir inmenging.

Derde generasie digitale PCR

Digitale PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) bereken die kopiegetal van die teikenvolgorde deur eindpuntopsporing, en kan akkurate absolute kwantitatiewe opsporing uitvoer sonder om interne kontroles en standaardkurwes te gebruik.

Digitale PCR gebruik eindpuntopsporing en is nie afhanklik van die Ct-waarde (siklusdrempel) nie, dus word die digitale PCR-reaksie minder deur die amplifikasie-doeltreffendheid beïnvloed, en die toleransie vir PCR-reaksie-inhibeerders word verbeter, met hoë akkuraatheid en reproduceerbaarheid.

As gevolg van die kenmerke van hoë sensitiwiteit en hoë akkuraatheid, word dit nie maklik deur PCR-reaksie-inhibeerders ingemeng nie, en dit kan ware absolute kwantifisering bereik sonder standaardprodukte, wat 'n navorsings- en toepassingshotspot geword het.

Volgens die verskillende vorme van die reaksie-eenheid kan dit in drie hooftipes verdeel word: mikrovloeistof-, skyfie- en druppelstelsels.

1) Mikrofluïdiese digitale PCR, mdPCR:

Gebaseer op die mikrofluïdiese tegnologie, word die DNA-sjabloon geskei.Die mikrofluïdiese tegnologie kan die monster nano-opgradering of die generering van kleiner druppels realiseer, maar die druppels benodig 'n spesiale adsorpsiemetode en dan gekombineer met die PCR-reaksiestelsel.mdPCR is geleidelik aangeneem deur ander metodes te vervang.

2) Druppelgebaseerde digitale PCR, ddPCR:

Gebruik water-in-olie druppel generasie tegnologie om die monster in druppels te verwerk, en verdeel die reaksiestelsel wat nukleïensuurmolekules bevat in duisende nanoskaal druppels, wat elkeen nie die nukleïensuur teikenmolekule bevat wat opgespoor moet word nie, of Bevat een tot verskeie nukleïensuurteikenmolekules wat getoets moet word.

3) Chip-gebaseerde digitale PCR, cdPCR:

Gebruik die geïntegreerde vloeistofbaan-tegnologie om baie mikrobuise en mikroholtes op silikonwafels of kwartsglas te graveer, en beheer die vloei van die oplossing deur verskillende beheerkleppe, en verdeel die monstervloeistof in nanometers van dieselfde grootte in die reaksieputte vir digitale PCR-reaksie om absolute kwantifisering te verkry.

Die belangrikste nadele van die derde generasie PCR:

Die toerusting en reagense is duur.

Die sjabloon kwaliteit vereistes is hoog.As die sjabloonhoeveelheid die mikrosisteemhoeveelheid oorskry, sal dit onmoontlik wees om te kwantifiseer, en as dit te klein is, sal die kwantifiseringsakkuraatheid verminder word.

Vals positiewe kan ook gegenereer word wanneer daar nie-spesifieke amplifikasie is.