COVID-19 is 'n aansteeklike siekte wat veroorsaak word deur Ernstige Akute Respiratoriese Sindroom Coronavirus Tipe 2. Wanneer 'n persoon besmet is, sluit die mees algemene simptome koors, hoes en kortasem in.

Die monsters wat vir toetsing gebruik word, kan deur nasofaryngeale deppers of orofaryngeale deppers versamel word.

Wat is PCR?

Die standaardmetode van koronavirusopsporing is polimerase kettingreaksie, PCR.Dit is 'n metode wat algemeen in molekulêre biologie gebruik word.Dit kan vinnig miljoene na miljarde spesifieke DNS-fragmente kopieer.

Die nuwe koronavirus bevat 'n baie lang enkelstring-RNA-genoom.Om hierdie virusse deur PCR op te spoor, moet RNA-molekules omgeskakel word in hul komplementêre DNA-volgordes deur omgekeerde transkriptase, en dan kan die nuut gesintetiseerde DNA deur standaard PCR-prosedures geamplifiseer word, wat algemeen bekend staan ​​as RT-PCR.

RT-PCR proses

RNA-ekstraksie

Om hierdie metode uit te voer, moet virale RNA basies onttrek word.'n Verskeidenheid RNA-suiweringsstelle kan gebruik word vir gerieflike, vinnige en effektiewe skeiding.

Om virale RNA te onttrek met 'n kommersiële kit, voeg eers die monster by 'n mikrosentrifugeerbuis en meng dit dan met die lysisbuffer.Hierdie buffer is hoogs gedenatureer en bestaan ​​gewoonlik uit fenol en guanidien isotiosianaat.Daarbenewens is RNase-inhibeerders gewoonlik teenwoordig in die lisisbuffer om isolasie van ongeskonde virale RNA te verseker.

Nadat die lysisbuffer bygevoeg is, draai die mengbuis met 'n puls en inkubeer by kamertemperatuur.Die virus word dan gelys onder hoogs denaturerende toestande wat deur die lisisbuffer verskaf word.

Nadat die monster gelys is, word 'n sentrifugeerbuis vir die suiweringsprosedure gebruik.Die monster word in die sentrifugebuis gelaai en dan gesentrifugeer.

Hierdie prosedure is 'n vastefase-ekstraksiemetode waarin die stilstaande fase uit 'n silikagelmatriks bestaan.

Onder optimale sout- en pH-toestande bind RNA-molekules aan die silikamembraan.

Terselfdertyd word proteïene en ander kontaminante verwyder.

Plaas die sentrifugeerbuis na sentrifugering in 'n skoon versamelbuis, gooi die filtraat weg en voeg dan wasbuffer by.

Plaas die buis weer in die sentrifuge om die wasbuffer deur die membraan te dwing.Dit sal alle oorblywende onsuiwerhede van die membraan verwyder, wat net die RNA aan die silikagel laat bind.

Nadat die monster gewas is, plaas die buis in 'n skoon mikrosentrifugeerbuis en voeg die elueringsbuffer by.

Dit word dan gesentrifugeer om die elueringsbuffer deur die membraan te dwing.Die elueringsbuffer verwyder virale RNA uit die spinkolom en verkry gesuiwerde RNA vry van proteïene, inhibeerders en ander kontaminante.

STAP 2

Gemengde konsentraat

Nadat die virale RNA onttrek is, is die volgende stap om die reaksiemengsel vir PCR-amplifikasie voor te berei.In hierdie stap word konsentraat gebruik.Hierdie gekonsentreerde oplossing is 'n voorafgemengde gekonsentreerde oplossing wat bestaan ​​uit 'n voormengsel, omgekeerde transkriptase, nukleotiede, voorwaartse primer, omgekeerde primer, TaqMan-sonde en DNA-polimerase.

Ten slotte, om hierdie reaksiemengsel te voltooi, word die RNA-sjabloon bygevoeg.Die buise word gemeng deur polsvortexing, en dan word die reaksiemengsel in die PCR-plaat gelaai.Die PCR-plaat bevat gewoonlik 96 putte en kan verskeie monsters op dieselfde tyd ontleed.

STAP 3

PCR-versterking

Plaas dan die plaat in die PCR-masjien, wat in wese 'n termiese fietsryer is.

Intydse RT-PCR word gebruik om die 2019 nuwe koronavirus op te spoor deur die teikenvolgorde in die RdrRP-geen, E-geen en N-geen te versterk.Die keuse van teikengeen hang af van die primer en probe volgorde.

Die eerste stap van RT-PCR is omgekeerde transkripsie.Die eerste string komplementêre DNA word gesintetiseer, wat geïnisieer word deur die PCR-omgekeerde primer, wat aan die komplementêre deel van die virale RNA-genoom bind.Dan voeg omgekeerde transkriptase DNA-nukleotiede by die 3'-punt van die primer om DNA komplementêr tot die virale RNA te sintetiseer.Die temperatuur en duur van hierdie stap hang af van die primers, teiken-RNA en omgekeerde transkriptase wat gebruik word.

Vervolgens word 'n aanvanklike denaturasiestap toegepas, wat lei tot die denaturering van die RNA-DNA baster.Hierdie stap is nodig om die DNA-polimerase te aktiveer.Terselfdertyd word omgekeerde transkriptase geïnaktiveer.

PCR bestaan ​​uit 'n reeks termiese siklusse.Elke siklus bestaan ​​uit denaturering, uitgloeiing en verlengingstappe.

Die denatureringsstap behels die verhitting van die reaksiekamer tot 95 grade Celsius en die gebruik daarvan vir denaturering van die dubbelstring-DNS-sjabloon.

In die volgende stap word die reaksietemperatuur verlaag tot 58 grade Celsius, wat die voorwaartse primer toelaat om aan die komplementêre deel van sy enkelstring-DNS-sjabloon te gloei.Die uitgloeitemperatuur hang direk af van die lengte en samestelling van die onderlaag.

In die uitbreidingstap sintetiseer die DNA-polimerase 'n nuwe DNA-string wat komplementêr is tot die DNA-sjabloonstring.Deur vrye kerne komplementêr tot die sjabloon by te voeg in die 5'tot 3'rigting vanaf die reaksiemengsel.Die temperatuur van hierdie stap hang af van die DNA-polimerase wat gebruik word.

Na die eerste siklus word 'n dubbelstring-DNS-teiken verkry.

Gaan dan na die tweede siklus.Die dubbelstring-DNS word gedenatureer om twee enkelstring-DNS-molekules te produseer.

In die volgende stap word die reaksietemperatuur verlaag, die primers word aan elke enkelstring-DNS-sjabloon gekoppel, en die Taq-man-sonde word aan die komplementêre deel van die teiken-DNS geklou.

Die TaqMan-probe bestaan ​​uit 'n fluorofoor wat kovalent gekoppel is aan die 5'-punt van die oligonukleotied-probe.Wanneer die ligbron van die fietsryer opgewonde raak, gee die fluorofoor fluoressensie uit.Daarbenewens is die sonde saamgestel uit 'n blusder aan die 3'-kant.Die nabyheid van die verslaggewergeen aan die uitblusmiddel verhoed die opsporing van fluoressensie.

In die uitbreidingstap sintetiseer die DNA-polimerase 'n nuwe string.Wanneer die polimerase die TaqMan-sonde bereik, klief sy endogene 5'-nuklease-aktiwiteit die sonde, wat die kleurstof van die blusder skei.

Met elke siklus van PCR word meer kleurstofmolekules vrygestel, wat lei tot 'n toename in fluoressensie-intensiteit eweredig aan die aantal amplikone wat gesintetiseer is.

Hierdie metode laat toe om die getal van 'n gegewe ry wat in die steekproef teenwoordig is, te skat.Die aantal dubbelstring-DNS-fragmente verdubbel in elke siklus.Daarom kan PCR gebruik word om baie klein monsters te ontleed.

Vir die meet van fluoresserende sein, wolfram halogeenlamp, opwekkingsfilter, reflektor, lens, emissiefilter en lading gekoppelde toestel-gebruik CCD-kamera.

STAP 4 Bespeur

Vir die meet van fluoresserende sein, wolfram halogeenlamp, opwekkingsfilter, reflektor, lens, emissiefilter en lading gekoppelde toestel-gebruik CCD-kamera.

Die gefiltreerde lig van die lamp word deur die weerkaatser weerkaats, gaan deur die kondensorlens en word na die middel van elke gaatjie gefokus.Dan word die fluoressensie wat deur die gat vrygestel word deur die spieël weerkaats, gaan deur die emissiefilter en word deur die CCD-kamera opgespoor.In elke PCR-siklus kan die selfopgewekte fluorofoorlig deur die CCD opgespoor word.

Dit omskep die vasgevang lig in digitale data.Hierdie metode word intydse PCR genoem, en dit laat intydse monitering van die vordering van die PCR-reaksie toe.