• facebook
  • gekoppel
  • youtube

As 'n nuwe een in die laboratorium is dit nie 'n goeie werk om positiewe plante uit 'n klomp plante met 'n lae omskakelingskoers uit te sif nie.Eerstens moet DNS een vir een uit 'n groot aantal monsters onttrek word, en dan sal die vreemde gene deur PCR opgespoor word.Die resultate is egter dikwels spasies en bande met 'n paar items af en toe, maar dit is onmoontlik om te bepaal of daar gemiste bespeurings of vals bespeurings is..Is dit baie hulpeloos om sulke eksperimentele proses en resultate in die gesig te staar?Moenie bekommerd wees nie, broer leer jou hoe om transgeniese positiewe plante maklik en akkuraat uit te sif.

Stap 1

Ontwerp deteksie primers

Vinnig 1

Bepaal die endogene geen en eksogene geen wat opgespoor moet word volgens die monster wat getoets moet word, en kies 'n verteenwoordigende 100-500bp volgorde in die geen vir primer ontwerp.Goeie primers kan die akkuraatheid van die opsporingsresultate verseker en die opsporingstyd verkort (sien die bylaag vir algemeen gebruikte opsporing primers).

Kennisgewing: Die nuut ontwerpte primers moet die reaksietoestande optimaliseer en die akkuraatheid, akkuraatheid en opsporingslimiet van die opsporing verifieer voor grootskaalse opsporing.

Stap 2

Ontwerp eksperimentele protokol

Vinnig 2

Positiewe beheer: Gebruik die gesuiwerde DNA wat die teikenfragment bevat as 'n templaat om te bepaal of die PKR-reaksiestelsel en toestande normaal is.

Negatiewe/blanke kontrole: Gebruik die DNA-sjabloon of ddH2O wat nie die teikenfragment bevat nie as 'n sjabloon om vas te stel of daar 'n bron van kontaminasie in die PCR-stelsel is.

Interne verwysingsbeheer: gebruik die primer/probe-kombinasie van die endogene geen van die monster wat getoets moet word om te evalueer of die templaat deur PCR opgespoor kan word.

Kennisgewing:

Positiewe, negatiewe/blanko kontroles en interne beheerkontroles moet vir elke toets gestel word om die geldigheid van die eksperimentele resultate te evalueer.

Eksperiment voorbereiding

Vinnig 3

Voor gebruik, kyk of die oplossing eweredig gemeng is.Indien neerslag gevind word, moet dit opgelos en gemeng word volgens die instruksies voor gebruik.2×PCR-mengsel moet gepipetteer en herhaaldelik met 'n mikropipet gemeng word voor gebruik om ongelyke ioonverspreiding te vermy.

Kennisgewing:

Haal die handleiding uit en lees dit noukeurig deur, en tref voorbereidings voor die eksperiment in streng ooreenstemming met die vereistes van die handleiding.

Stap 4

Berei PCR-reaksiestelsel voor

Vinnig 4

Volgens die eksperimentele protokol, meng die primers, H2O en 2×PCR meng eweredig, sentrifugeer en versprei dit na elke reaksiebuis.

Kennisgewing:

Vir grootskaalse of langtermyntoetsing word dit aanbeveel om 'n PCR-reaksiestelsel te gebruik wat UNG-ensiem bevat, wat aërosolbesmetting wat deur PCR-produkte veroorsaak word, effektief kan vermy.

Stap 5

Voeg reaksiesjabloon by

Vinnig 5

Deur direkte PCR-tegnologie te gebruik, is daar geen behoefte aan vervelige nukleïensuursuiweringsproses nie, die monstersjabloon kan binne 10 minute voorberei word, en die ooreenstemmende PCR-reaksiestelsel kan bygevoeg word.

Kennisgewing:

Die splitsingsmetode het 'n beter opsporing-effek, en die verkrygde produk kan vir veelvuldige opsporingsreaksies gebruik word.

Vinnig 6

5.1: Direkte uitbreiding van blare

Volgens die grootte van die prentjie in die handleiding, sny die blaarweefsel met 'n deursnee van 2-3mm en plaas dit in die PCR-reaksiestelsel.

Let wel: Maak seker dat die blaarfragmente heeltemal in die PCR-reaksieoplossing gedompel is, en moenie oormatige blaarweefsel byvoeg nie.

5.2: Blaarsplitmetode

Sny die blaarweefsel met 'n deursnee van 5-7mm en plaas dit in 'n sentrifugebuis.As jy volwasse blare kies, vermy asseblief die gebruik van die weefsels van die hoofaar van die blaar.Pipetteer 50ul Buffer P1-lisaat in 'n sentrifugebuis om te verseker dat die lysaat die blaarweefsel heeltemal kan onderdompel, plaas dit in 'n termiese siklus of metaalbad, en liseer by 95°C vir 5-10 minute.

Vinnig 7

Voeg 50 ul Buffer P2 neutralisasie oplossing by en meng goed.Die resulterende lysaat kan as 'n templaat gebruik word en by die PCR-reaksiestelsel gevoeg word.

Let wel: Die hoeveelheid sjabloon is tussen 5-10% van die PKR-stelsel, en moet nie 20% oorskry nie (byvoorbeeld, in 'n 20μl PKR-stelsel, voeg 1-2μl lisis-oplossing by, nie meer as 4μl nie).

Stap 6

PCR reaksie

Vinnig 8

Nadat die PCR-reaksiebuis gesentrifugeer is, word dit in 'n PCR-instrument geplaas vir amplifikasie.

Kennisgewing:

Die reaksie gebruik nie-gesuiwerde sjabloon vir amplifikasie, dus is die aantal amplifikasiesiklusse 5-10 meer siklusse as wanneer gesuiwerde DNA-sjabloon gebruik word.

Stap 7

Elektroforese-opsporing en resultaat-analise

Vinnig9

M: 100bp DNA-leer

1\4: Gesuiwerde DNA-metode

2\5: Direkte PCR-metode

3\6: Leë beheer

QC:

Die toetsresultate van die verskillende kontroles wat in die eksperiment gestel is, moet aan die volgende voorwaardes voldoen.Andersins moet die oorsaak van die probleem ontleed word, en die toets moet weer uitgevoer word nadat die probleem uitgeskakel is.

Tabel 1. Normale toetsresultate van verskeie kontrolegroepe

*Wanneer die plasmied as 'n positiewe kontrole gebruik word, kan die endogene geentoetsresultaat negatief wees

Uitslag oordeel:

A. Die toetsresultaat van die endogene geen van die monster is negatief, wat aandui dat die DNS wat geskik is vir gewone PKR-opsporing nie uit die monster onttrek kan word nie of die onttrekte DNS bevat PKR-reaksie-inhibeerders, en die DNS moet weer onttrek word.

B. Die toetsresultaat van die endogene geen van die monster is positief, en die toetsresultaat van die eksogene geen is negatief, wat aandui dat DNS wat geskik is vir gewone PCR-opsporing uit die monster onttrek word, en daar kan geoordeel word dat die XXX-geen nie in die monster opgespoor word nie.

C. Die toetsresultaat van die endogene geen van die monster is positief, en die toetsresultaat van die eksogene geen is positief, wat aandui dat DNS geskik is vir gewone PKR-opsporing uit die monster onttrek is, en die monster DNS bevat die XXX geen.Bevestigingseksperimente kan verder uitgevoer word.

Stap 8

Ontwerp deteksie primers

Vinnig10

Gebruik na die eksperiment 2% natriumhipochlorietoplossing en 70% etanoloplossing om die eksperimentele area af te vee om omgewingsbesoedeling te voorkom.


Postyd: Sep-08-2021