Ⅰ. Verhoog die sensitiwiteit van die reaksiestelsel:

1. Skei hoë kwaliteit RNA:

Suksesvolle cDNA-sintese kom van hoë kwaliteit RNA.Hoë-gehalte RNA behoort ten minste 'n totaal langer te verseker en bevat nie inhibeerders wat nie opname-ensieme bevat nie, soos EDTA of SDS.Die kwaliteit van RNA bepaal die maksimum waarde van die volgorde-inligting wat jy na die cDNA kan transkribeer.Die algemene RNA-suiweringsmetode is 'n stapmetode om isososianaat/asidofenol te gebruik.Ten einde die besoedeling van RNase te voorkom, vereis die RNA wat geskei is van 'n monster ryk aan RNase (soos pankreas) berging van formaldehied om RNA van hoë gehalte te red, wat selfs meer so is vir langtermynberging.Die RNA wat uit die rotlewer onttrek is, is basies afgebreek na een week se berging in water, terwyl die RNA wat uit die rotmilt onttrek is, stabiel gebly het na drie jaar se berging in water.Daarbenewens is transkripsies groter as 4kb meer sensitief vir spoor RNase-afbraak as klein transkripsies.Om die stabiliteit van die bergings-RNA-monster te verhoog, kan die RNA opgelos word in 'n metalmamien van ioon, en word -70 °C gestoor.Tilied wat gebruik word om RNA te red, mag nie 'n diverse voorwerp bevat wat RNA afbreek nie.RNA, wat van pankreas afkomstig is, kan vir ten minste een jaar in metalmamien gestoor word.Wanneer jy gereed is om RNA te gebruik, kan jy die volgende metodes gebruik om RNA te presipiteer: voeg NaCl by 0.2m en 4 keer die volume etanol, plaas kamertemperatuur vir 3-5 minute en 10 000 × g sentrifugeer vir 5 minute.

2. Gebruik omgekeerde transkriptase sonder RNaseH-aktiwiteit (RNaseH-):

RNase-inhibeerders word dikwels by omgekeerde transkripsie-reaksies gevoeg om die lengte en opbrengs van cDNA-sintese te verhoog.RNase-inhibeerder word bygevoeg in die eerste kettingsintese-reaksie in die teenwoordigheid van buffers en reduseermiddels soos DTT omdat die pre-cDNA-sinteseproses die inhibeerder denatureer, en sodoende gebonde RNases vrystel wat RNA afbreek.Proteïen RNase inhibeerder verhoed slegs die afbraak van RNA deur RNase A, B, C, en verhoed nie RNases op die vel nie, so sorg moet gedra word om nie RNases vanaf die vingers in te voer ten spyte van die gebruik van hierdie inhibeerders nie.

Omgekeerde transkriptase kataliseer die omskakeling van RNA in cDNA.Beide M-MLV en AMV het endogene RNaseH-aktiwiteit bykomend tot hul eie polimerase-aktiwiteit.RNaseH-aktiwiteit kompeteer met polimerase-aktiwiteit vir heterosigotiese stringe wat tussen RNA-sjablone en DNA-inleiders of cDNA-verlengstringe gevorm word, en degradeer RNA: RNA-stringe in DNA-komplekse.RNA-sjablone wat deur RNaseH-aktiwiteit afgebreek word, kan nie meer as effektiewe substrate vir cDNA-sintese gebruik word nie, wat die opbrengs en lengte van cDNA-sintese verminder.Dus sal die uitskakeling of grootliks vermindering van RNaseH-aktiwiteit van omgekeerde transkriptase tot groot voordeel wees.

SuperScriptⅡ omgekeerde transkriptase, MMLV omgekeerde transkriptase van RNaseH- en termoSkript omgekeerde transkriptase, AMV van RNaseH- het meer vollengte cDNA as MMLV en AMV opgelewer.RT-PKR sensitiwiteit word beïnvloed deur die hoeveelheid cDNA wat gesintetiseer word.ThermoScript is baie meer sensitief as AMV.Die grootte van RT-PCR produkte word beperk deur die vermoë van omgekeerde transkriptase om cDNA te sintetiseer, veral wanneer groter Cdna's gekloon word.In vergelyking met MMLV, het SuperScripⅡ die opbrengs van lang RT-PCR produkte aansienlik verhoog.RNaseH- se omgekeerde transkriptase verhoog ook termiese stabiliteit, sodat die reaksie by temperature hoër as normaalweg van 37-42 ℃ uitgevoer kan word.Onder die voorgestelde sintese toestande is oligo(dT) primers en 10μCi [alfa-p]dCTP gebruik.Die totale produksie van die eerste ketting is met behulp van die TCA-presipitasiemetode bereken.Vollengte cDNA is ontleed deur gebruik te maak van grootte-gesorteerde strookverwydering en telling in 'n alkaliese agarosegel.

3. Verhoog die hittebewaringstemperatuur van omgekeerde transkripsie:

Hoër houtemperatuur help om die sekondêre struktuur van RNA oop te maak en die opbrengs van die reaksie te verhoog.Vir die meeste RNA-sjablone elimineer die meeste sekondêre strukture die meeste sekondêre strukture om die RNA en primer by 65°C sonder buffer of sout te hou en dan vinnig op ys af te koel en laat die primers bind.Sommige sjablone het egter steeds sekondêre struktuur, selfs na termiese denaturering.Amplifikasie van hierdie moeilike sjablone kan uitgevoer word deur gebruik te maak van ThermoScript omgekeerde transkriptase en deur die omgekeerde transkriptase reaksie by hoër temperature te plaas om amplifikasie te verbeter.Hoër houtemperature kan ook spesifisiteit verhoog, veral wanneer cDNA-sintese uitgevoer word deur gebruik te maak van geenspesifieke primers (GSPS) (sien Hoofstuk 3).As jy GSP gebruik, maak seker dat die Tm-waarde van die onderlaag dieselfde is as die verwagte houtemperatuur.Moenie oligo(dT) en ewekansige primers bo 60℃ gebruik nie.Willekeurige primers moet vir 10 minute by 25 ℃ gehou word voordat dit verhoog word tot 60 ℃.Benewens die gebruik van hoër omgekeerde transkripsietemperature, kan spesifisiteit verbeter word deur die RNA/primermengsel direk oor te dra van die 65℃ denaturerende temperatuur na die omgekeerde transkripsiehoutemperatuur en 'n voorverhitte 2× reaksiemengsel (cDNA termiese inisiasie sintese) by te voeg.Hierdie benadering help om die intermolekulêre basisparing te voorkom wat by laer temperature plaasvind.Die gebruik van 'n PCR-instrument vereenvoudig die baie temperatuurskakelaars wat vir RT-PCR benodig word.

Die hitte-gestabiliseerde polimerase tree op as DNA-polimerase in die teenwoordigheid van Mg2+ en RNA-polimerase in die teenwoordigheid van Mn2+.Dit kan hitte tot 65 ℃ hou.Die teenwoordigheid van Mn2+ tydens PCR verminder egter getrouheid, wat Tth-polimerase minder geskik maak vir hoë presisie amplifikasie, soos cDNA-kloning.Daarbenewens is Tth minder doeltreffend by omgekeerde transkripsie, wat sensitiwiteit verminder, en aangesien 'n enkele ensiem omgekeerde transkripsie en PCR kan uitvoer, kan beheerreaksies sonder omgekeerde transkripsie nie gebruik word om geamplifiseerde produkte van cDNA van dié van besmette genomiese DNA te onderskei nie.

4. Byvoeging wat omgekeerde transkripsie bevorder:

Die byvoeging van bymiddels, insluitend gliserien en DMSO, by die eerste kettingsintese reaksie kan die stabiliteit van die nukleïensuur dubbelstring verminder en die RNA se sekondêre struktuur afwikkel.Tot 20% gliserien of 10% DMSO kan bygevoeg word sonder om die aktiwiteit van SuperScriptⅡ of MMLV te beïnvloed.AMV kan ook tot 20% gliserol verdra sonder om aktiwiteit te verminder.Om die sensitiwiteit van RT-PCR in SuperScriptⅡ omgekeerde transkripsie reaksie te maksimeer, kan 10% gliserol bygevoeg en geïsoleer word by 45℃.Indien 1/10 van die retrotranskripsie-reaksieproduk by die PCR gevoeg word, is die konsentrasie gliserol in die amplifikasiereaksie 0,4%, wat nie genoeg is om PCR te inhibeer nie.

5. RNaseH verwerking:

Sensitiwiteit kan verbeter word deur cDNA sintesereaksies met RNaseH voor PCR te behandel.Vir sommige sjablone word gedink dat die RNA in die cDNA-sintesereaksie die binding van geamplifiseerde produkte voorkom, in welke geval die RNaseH-behandeling sensitiwiteit kan verhoog.Oor die algemeen word RNaseH-behandeling benodig vir die amplifikasie van 'n relatief lang vollengte cDNA-teikensjabloon, soos tuberous scherosisⅡ met lae kopie.Vir hierdie moeilike sjabloon het RNaseH die sein verbeter wat gegenereer word deur die cDNA wat deur SuperScriptⅡ of AMV gesintetiseer is.Vir die meeste RT-PCR-reaksies is die RNaseH-behandeling opsioneel omdat die 95℃-geïsoleerde PCR-denaturasiestap tipies die RNA van die RNA: DNA-kompleks hidroliseer.

6. Verbeterde metodes vir die opsporing van klein hoeveelhede RNA:

RT-PKR is veral uitdagend wanneer slegs klein hoeveelhede RNA beskikbaar is.Die byvoeging van glikogeen as 'n draer tydens RNA-skeiding help om die opbrengs van klein monsters te verhoog.'n RNase-vrye glikogeen kan op dieselfde tyd as Trizol bygevoeg word.Glikogeen is wateroplosbaar en kan saam met RNA in die waterfase bly om te help met daaropvolgende presipitasie.Die aanbevole konsentrasie RNase-vrye glikogeen is 250μg/ml vir monsters minder as 50mg weefsel of 106 gekweekte selle.

Die byvoeging van asetileerde BSA om omgekeerde transkripsie-reaksies met behulp van SuperScriptⅡ kan die sensitiwiteit verhoog, en vir klein hoeveelhede RNA kan die vermindering van die hoeveelheid SuperScriptⅡ en die byvoeging van 40 eenhede RNaseOut-nuklease-inhibeerder die opsporingsvlak verbeter.Indien glikogeen in RNA-skeiding gebruik word, word die byvoeging van BSA- of RNase-inhibeerders om transkripsie-reaksies om te keer met behulp van SuperScriptⅡ steeds aanbeveel.

Ⅱ. Verhoog die spesifisiteit van RT-PCR

1. cNDA sintese:

Drie verskillende metodes kan gebruik word om eerste string cDNA sintese te inisieer, en die relatiewe spesifisiteit van elke metode beïnvloed die hoeveelheid en tipe cDNA wat gesintetiseer word.

Random primer metode is die minste spesifiek van die drie metodes.Primers word op verskeie plekke regdeur die transkripsie uitgegloei om kort, gedeeltelike lengte cDNA te produseer.Hierdie metode word dikwels gebruik om 5'-terminale volgordes en cDNA te verkry vanaf RNA-sjablone met sekondêre strukturele streke of met terminerende plekke wat omgekeerde transkriptase nie kan repliseer nie.Om die langste cDNA te verkry, moet die verhouding van primers tot RNA in elke RNA-monster empiries bepaal word.Die aanvanklike konsentrasie van ewekansige primers wissel van 50 tot 250ng per 20μl reaksiestelsel.Omdat die cDNA gesintetiseer vanaf totale RNA met behulp van ewekansige primers hoofsaaklik ribosomale RNA is, word poli(A)+RNA oor die algemeen as die templaat gekies.

Oligo(dT)-inisiasie is meer spesifiek as ewekansige primers.Dit hibridiseer met die poli(A)-stert wat aan die 3'-punt van mRNA in die meeste eukariotiese selle gevind word.Omdat poli(A)+RNA rofweg 1% tot 2% van totale RNA is, is die hoeveelheid en kompleksiteit van cDNA baie minder as wanneer ewekansige primers gebruik word.As gevolg van sy hoë spesifisiteit, benodig oligo(dT) oor die algemeen nie optimalisering vir RNA tot primer verhouding en poli(A)+ seleksie nie.Dit word aanbeveel om 0.5μg oligo(dT) per 20μl reaksiestelsel te gebruik.oligo(dT)12-18 is geskik vir die meeste RT-PCR.ThermoScript RT-PCR-stelsel verskaf oligo(dT)20 vanweë sy goeie termiese stabiliteit en is geskik vir hoër houtemperature.

Geen-spesifieke primers (GSP) is die beste spesifieke primers vir die omgekeerde transkripsiestap.GSP is 'n antisense-oligonukleosied wat spesifiek met RNA-bestemmingsvolgorde kan hibridiseer, eerder as om alle Rna's soos ewekansige primers of oligo(dT) te uitgloei.Die reëls wat gebruik word om PCR-primers te ontwerp is ook van toepassing op die ontwerp van omgekeerde transkripsie reaksie GSP.GSP kan dieselfde volgorde wees as die amplifikasie-primer wat aan die einde van mRNA3′ uitgegloei is, of GSP kan ontwerp word om stroomaf met die omgekeerde amplifikasie-primer te gloei.Vir sommige geamplifiseerde voorwerpe is dit nodig om meer as een antisense primer te ontwerp vir suksesvolle RT-PCR omdat die sekondêre struktuur van die teiken RNA kan verhoed dat die primer bind.Daar word voorgestel om 1pmol antisense GSP in die eerste kettingsintese reaksie sisteem van 20μl te gebruik.

2. Verhoog die hittebewaringstemperatuur van omgekeerde transkripsie:

Om die GSP-spesifisiteit ten volle te benut, moet omgekeerde transkriptase met hoë termiese stabiliteit gebruik word.Hitte-stabiele omgekeerde transkriptase kan by hoër temperature geïsoleer word om reaksie strengheid te verhoog.Byvoorbeeld, as 'n GSP by 55°C uitgegloei word, dan word die spesifisiteit van GSP nie ten volle benut as omgekeerde transkripsie uitgevoer word by 37°C met lae strengheid deur gebruik te maak van AMV of M-MLV nie.SuperScripⅡ en ThermoScript kan egter by 50 ℃ of hoër reageer, wat nie-spesifieke produkte wat by laer temperature vervaardig word, uitskakel.Vir maksimum spesifisiteit kan die RNA/primermengsel direk vanaf die 65℃ denaturasietemperatuur na die omgekeerde transkripsie-houtemperatuur oorgedra word met die byvoeging van 'n voorverhitte 2 x reaksiemengsel (termiese aanvang van cDNA-sintese).Dit help om basisparing tussen molekules by lae temperature te voorkom.Die gebruik van 'n PKR-instrument vereenvoudig die baie temperatuuroorgange wat vir RT-PKR vereis word.

3. Verminder genomiese DNA-besmetting:

Een potensiële probleem met RT-PCR is dat RNA genomiese DNA besoedel.Die gebruik van beter RNA-skeidingsmetodes, soos Trizol Reagens, verminder genomiese DNA-besmetting in RNA-preparate.Om produkte wat uit genomiese DNA vervaardig word te vermy, kan die RNA behandel word met amplifikasiegraad DnasⅠ om besmette DNA te verwyder voor omgekeerde transkripsie.Die monsters is vir 10 minute by 65℃ in 2.0mM EDTA gehou om DNaseⅠ-vertering te beëindig.EDTA chelaat magnesiumione om die magnesiumioon-afhanklike RNA-hidrolise wat by hoë temperature plaasvind, te voorkom.

Ten einde geamplifiseerde cDNA van die genoom-DNA-amplifikasieproduk te skei, kan primers wat afsonderlik met die geskeide ekson analiseer, ontwerp word.PCR-produkte afkomstig van cDNA sal korter wees as dié afkomstig van gekontamineerde genomiese DNA.'n Gekontroleerde eksperiment sonder omgekeerde transkripsie word ook op elke RNA-sjabloon uitgevoer om te bepaal of 'n gegewe fragment van genomiese DNA of cDNA is.PKR-produkte wat in die afwesigheid van omgekeerde transkripsie verkry word, word van die genoom afgelei.

Verwante produk

RT-PCR Maklik^ᵀᴹEk (Een Stap)

-Die eenstap-stel maak dit moontlik om omgekeerde transkripsie en PCR in dieselfde buis uit te voer.Dit hoef slegs templaat-RNA, spesifieke PCR-inleiders en RNase-vrye ddH by te voeg₂O.

-Intydse kwantitatiewe ontleding van RNA kan vinnig en akkuraat uitgevoer word.

-Die stel gebruik 'n unieke Foregene-omgekeerde transkripsie-reagens en Foregene HotStar Taq DNA Polimerase gekombineer met 'n unieke reaksiestelsel om die amplifikasie-doeltreffendheid en spesifisiteit van die reaksie effektief te verbeter.

-Die geoptimaliseerde reaksiestelsel maak dat die reaksie 'n hoër opsporingsensitiwiteit, sterker termiese stabiliteit en beter verdraagsaamheid het.

RT Easy II(Met GDNase) Meestervoormengsel vir eerste-string CDNA-sintese vir intydse PCR met GDNase

-Doeltreffende vermoë om gDNA te verwyder, wat gDNA binne 2 minute in die sjabloon kan verwyder.

-Doeltreffende omgekeerde transkripsiestelsel, dit neem slegs 15 minute om die sintese van die eerste string cDNA te voltooi.

-Komplekse sjablone: ​​sjablone met 'n hoë GC-inhoud en komplekse sekondêre struktuur kan ook met 'n hoë doeltreffendheid omgekeer word.

-Hoë-sensitiwiteit omgekeerde transkripsie stelsel, pg-vlak sjablone kan ook hoë kwaliteit cDNA kry.

-Die omgekeerde transkripsiestelsel het hoë termiese stabiliteit, die optimale reaksietemperatuur is 42℃, en dit het steeds goeie omgekeerde transkripsieprestasie by 50℃.