Tradisionele omgekeerde transkriptases kan nie hoë temperature verdra nie (die optimale temperatuur vir MMLV-aktiwiteit is 37-50°C, en AMV is 42-60°C).Die meer komplekse virale RNA kan nie effektief omgekeerd getranskribeer word in cDNA by lae temperature nie, wat lei tot opsporing doeltreffendheid Die vermindering.Tradisionele RT-qPCR vereis oor die algemeen die deelname van twee sleutelensieme (omgekeerde transkriptase en DNA-polimerase), wat dit onmoontlik maak om die werking van die reaksiestelsel te vereenvoudig en die koste te verminder.Hier sal ons twee hoë-temperatuur-bestande omgekeerde transkriptases bekendstel, TtH en RevTaq.Hierdie twee ensieme het ook die funksie van DNA-polimerase, daarom word hulle bifunksionele ensieme genoem.

TtH DNA polimerase

Jy het seker gehoor van TtH, wat afgelei is van die termofiele bakterie Thermus thermophilus HB8.In die teenwoordigheid van tweewaardige katione soos Mg2+, het dit DNA-polimerase-aktiwiteit.Dit word wyd gebruik in PCR-reaksies soos Taq-ensiem, maar dit het hoër hittebestandheid as Taq-ensiem, so dit het ook 'n beter effek op PCR met hoë GC-inhoud sjablone.

· Hierdie ensiem het basies geen 3′→5′-eksonuklease-aktiwiteit en 5′→3′-eksonuklease-aktiwiteit nie, dus kan dit ook vir dideoksie-volgordebepaling gebruik word.

· Hierdie ensiem het RTase-aktiwiteit.In die teenwoordigheid van Mn2+ sal RTase-aktiwiteit verbeter word.Deur hierdie kenmerk te gebruik, kan dit gebruik word om omgekeerde transkripsie-reaksie en PCR-reaksie in dieselfde buis uit te voer, dit wil sê een-stap RT-PCR.In die teenwoordigheid van Mn2+ is die akkuraatheid van RT-PCR egter nie hoog nie.RT-aktiwiteit het niks met rnaase H-aktiwiteit te doen nie.

· Die verhoogde aktiwiteit van Tth-DNA-polimerase (pH9, optimum +55℃～+70℃, maksimum +95℃) oorkom die probleme wat deur RNA se sekondêre struktuur veroorsaak word.Die resulterende cDNA kan geamplifiseer word deur PCR met dieselfde ensiem in die teenwoordigheid van Mg2+ ione.

· Die vermoë van Tth-DNA-polimerase om omgekeerde transkripsie en DNA-amplifikasie by hoë temperature uit te voer, maak hierdie ensiem bruikbaar vir kwantitatiewe RT-PKR, kloning en geenuitdrukking-analise van sellulêre en virale RNA.
· Tth-DNA polimerase word gebruik vir RT-PCR om RNA tot 1kb te amplifiseer.

Kenmerke en voordele

Tde DNA-polimerase:

• Verseker die geoptimaliseerde polimerase kettingreaksie (PCR) produk grootte, ten minste 1000 bp in die RT-PCR reaksie

• Aanvaar gemodifiseerde deoksiribonukleosiedtrifosfaat as 'n substraat

• Nie verwant aan RNase H-aktiwiteit nie

• Het hoë termiese stabiliteit om probleme te oorkom, gewoonlik verwant aan die hoë sekondêre struktuur teenwoordig in RNA

RevTaq RT-PCR DNA-polimerase

'n Hittebestande DNA-polimerase met omgekeerde transkriptase-aktiwiteit

RevTaq-RT-PCR-DNA-polimerase is 'n gemanipuleerde, hoogs hittebestande, dubbelfunksionele ensiem met omgekeerde transkriptase en DNA-polimerase-aktiwiteite verkry deur gerigte en kunsmatige evolusie.

· Die halfleeftyd van RevTaq RT-PCR DNA-polimerase by 95°C is langer as 40 minute.

· RevTaq RT-PCR DNA-polimerase laat hoë-temperatuur omgekeerde transkripsie direk vanaf die RNA-sjabloon toe, en die omgekeerde transkripsiestap kan verskeie kere herhaal word om meer cDNA-template te genereer.

· RevTaq RT-PCR DNA-polimerase laat “zero-step” RT-PCR toe (geen isotermiese omgekeerde transkripsiestap nie), want in die sikliese PCR-verlengingstap vind omgekeerde transkripsie en DNA-amplifikasie gelyktydig plaas.Dit bevorder ook die omgekeerde transkripsie reaksie by hoë temperature, waardeur die probleme wat ondervind word om die sterk sekondêre struktuur in RNA by hoë temperature te smelt, tot die minimum beperk word.

· As gevolg van die aptamer-gebaseerde warmbeginformule, sal RevTaq RT-PCR DNA-polimerase beter resultate lewer wanneer die uitgloei- en verlengingstemperatuur hoër as 57°C is.

· Aangesien die ensiem hittebestand is, word dit aanbeveel om primers en probes met baie hoë smeltpunte (>60°C) te ontwerp.

· Dit word aanbeveel om die temperatuur van die uitgloei-/verlengstap te optimaliseer deur 'n temperatuurgradiënt tydens die reaksie-opstellingsproses.

· Hoe hoër die temperatuur, hoe hoër is die spesifisiteit van PCR.Die omgekeerde transkripsie-siklus word gewoonlik by 'n hoër temperatuur as die PCR-siklus uitgevoer, omdat DNA Primer:RNA Template hibridisasie gewoonlik 'n hoër smeltpunt het as DNA Primer:cDNA Template dupleks.

· RevTaq RT-PCR DNA-polimerase is geneties gemanipuleer en geoptimaliseer, en die amplikongrootte is tussen 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNA polimerase opsporing limiet bereik 4 kopieë/

Die geoptimaliseerde reaksie sisteem (die vestiging van hoë smeltpunt primers) word in die figuur getoon.RevTaq RT-PCR DNA-polimerase-gedrewe RT-PCR toon beter sensitiwiteit as TaqPath 1-stap RT-qPCR meestermengsel, en laer opsporing Monster verdunningsgradiënt.

Meer voordele:

Vinnige beginfunksie → Die aanvanklike termiese denaturasiestap kan oorgeslaan word.

Warmstart aptamer formule → Verskaf onmiddellik 100% ensiemaktiwiteit en voorkom nie-spesifieke amplifikasie by lae temperature (<57°C).

Splitsingsfunksie → Die RNA-ekstraksiestap word weggelaat, want RevTaq RT-PCR DNA-polimerase kan ook ru-reaksiemonsters verwerk.Dit kan onmiddellik die selmembrane van eukariote, bakterieë en virusse in 'n warm RT-PCR-siklus vernietig.

IVD grondstof vlak → hoë kwaliteit standaarde en uiters mededingende pryse