• PCR is 'n metode wat gebruik word om DNA van 'n klein hoeveelheid DNA-sjabloon te amplifiseer.RT-PCR gebruik omgekeerde transkripsie om 'n DNA-sjabloon van 'n RNA-bron te produseer wat dan geamplifiseer kan word.
• PCR en RT-PCR is tipies eindpuntreaksies, terwyl qPCR en RT-qPCR die kinetika van die tempo van produksintese tydens die PCR-reaksie gebruik om die hoeveelheid templaat teenwoordig te kwantifiseer.
• Nuwer metodes, soos digitale PCR, verskaf absolute kwantifisering van die aanvanklike DNA-sjabloon, terwyl metodes soos isotermiese PCR die behoefte aan duur toerusting verminder om betroubare resultate te verskaf.

Polimerase kettingreaksie (PCR) is 'n relatief eenvoudige en algemeen gebruikte molekulêre biologie tegniek om DNA- en RNA-volgordes te versterk en op te spoor.In vergelyking met tradisionele metodes van DNS-kloning en -amplifikasie, wat dikwels dae kan neem, benodig PCR slegs 'n paar uur.PCR is hoogs sensitief en vereis minimale sjabloon vir opsporing en amplifikasie van spesifieke volgordes.Basiese PCR-metodes het verder gevorder vanaf eenvoudige DNA- en RNA-opsporing.Hieronder het ons 'n oorsig verskaf van die verskillende PCR-metodes en die reagense wat ons by Enzo Life Sciences verskaf vir jou navorsingsbehoeftes.Ons poog om wetenskaplikes vinnig toegang tot PCR-reagense te help om in hul volgende navorsingsprojek te gebruik!

PCR

Vir standaard PCR is al wat jy nodig het 'n DNA-polimerase, magnesium, nukleotiede, primers, die DNA-sjabloon wat geamplifiseer moet word, en 'n termosikleerder.Die PCR-meganisme is so eenvoudig soos sy doel: 1) dubbelstring-DNA (dsDNA) is hitte-gedenatureer, 2) primers belyn met die enkel DNA-stringe, en 3) die primers word verleng deur DNA-polimerase, wat lei tot twee kopieë van die oorspronklike DNA-string.Die denaturerings-, uitgloei- en verlengingsproses oor 'n reeks temperature en tye staan ​​bekend as een siklus van amplifikasie (Fig. 1).

Elke stap van die siklus moet geoptimaliseer word vir die sjabloon en onderlaagstel wat gebruik word.Hierdie siklus word ongeveer 20-40 keer herhaal, en die geamplifiseerde produk kan dan geanaliseer word, tipies deur agarosegel (Fig. 2).

Aangesien PCR 'n hoogs sensitiewe metode is en baie klein volumes benodig word vir enkelreaksies, word die voorbereiding van 'n meestermengsel vir verskeie reaksies aanbeveel.Die hoofmengsel moet goed gemeng word en dan volgens die aantal reaksies verdeel word, om te verseker dat elke reaksie dieselfde hoeveelheid ensiem, dNTP's en primers sal bevat.Baie verskaffers, soos Enzo Life Sciences, bied ook PCR-mengsels aan wat reeds alles bevat behalwe primers en die DNA-sjabloon.

Guanien/Sitosienryke (GC-ryke) streke verteenwoordig 'n uitdaging in standaard PCR-tegnieke.GC-ryke reekse is meer stabiel as reekse met laer GC-inhoud.Verder is GC-ryke rye geneig om sekondêre strukture te vorm, soos haarnaaldlusse.As gevolg hiervan is GC-ryke dubbelstringe moeilik om heeltemal te skei tydens die denaturasiefase.Gevolglik kan DNS-polimerase nie die nuwe string sonder belemmering sintetiseer nie.'n Hoër denatureringstemperatuur kan dit verbeter, en aanpassings na 'n hoër uitgloeitemperatuur en korter uitgloeityd kan die onspesifieke binding van GC-ryke primers voorkom.Bykomende reagense kan die amplifikasie van GC-ryke volgordes verbeter.DMSO, gliserol en betaïen help om die sekondêre strukture wat deur GC-interaksies veroorsaak word te ontwrig en sodoende die skeiding van die dubbelstringe te vergemaklik.

Hot Start PCR

Onspesifieke amplifikasie is 'n probleem wat tydens PCR kan voorkom.Die meeste DNA-polimerases wat vir PCR gebruik word, werk die beste by temperature rondom 68°C tot 72°C.Die ensiem kan egter ook aktief wees by laer temperature, hoewel in 'n laer mate.By temperature ver onder die uitgloeiingstemperatuur kan primers nie-spesifiek bind en lei tot nie-spesifieke amplifikasie, selfs al word die reaksie op ys opgestel.Dit kan voorkom word deur polimerase-inhibeerders te gebruik wat eers van die DNA-polimerase dissosieer sodra 'n sekere temperatuur bereik is, vandaar die term warmbegin PCR.Die inhibeerder kan 'n teenliggaam wees wat die polimerase bind en denatureer by die aanvanklike denatureringstemperatuur (95°C tipies).

High Fidelity Polimerase

Terwyl DNA-polimerases redelik akkuraat tot die oorspronklike sjabloonvolgorde amplifiseer, kan foute in nukleotiedpassing voorkom.Wanpassings in toepassings soos kloning kan lei tot afgekapte transkripsies, en verkeerd vertaalde of onaktiewe proteïene stroomaf.Om hierdie wanverhoudings te vermy, is polimerases met 'n "proeflees"-aktiwiteit geïdentifiseer en in die werkvloei geïnkorporeer.Die eerste proefleespolimerase, Pfu, is in 1991 in Pyrococcus furiosus geïdentifiseer.Hierdie Pfu-ensiem het 'n 3'- tot 5'-eksonuklease-aktiwiteit.Soos die DNA geamplifiseer word, verwyder die eksonuklease nie-ooreenstemmende nukleotiede aan die 3'-punt van die string.Die korrekte nukleotied word dan vervang, en DNA-sintese gaan voort.Die identifikasie van verkeerde nukleotiedvolgordes is gebaseer op die bindingsaffiniteit vir die korrekte nukleosiedtrifosfaat met die ensiem, waar ondoeltreffende binding die sintese vertraag en die korrekte vervanging moontlik maak.Die proefleesaktiwiteit van Pfu-polimerase lei tot minder foute in die finale volgorde in vergelyking met Taq DNA-polimerase.In onlangse jare is ander proeflees-ensieme geïdentifiseer, en modifikasies van die oorspronklike Pfu-ensiem is aangebring om die foutkoers tydens DNA-amplifikasie verder te verminder.

RT-PKR

Omgekeerde transkripsie PCR, of RT-PCR, laat die gebruik van RNA as 'n templaat toe.'n Bykomende stap laat die opsporing en amplifikasie van RNA toe.Die RNA word omgekeerd getranskribeer in komplementêre DNA (cDNA), met behulp van omgekeerde transkripsie.Die kwaliteit en suiwerheid van die RNA-sjabloon is noodsaaklik vir die sukses van RT-PCR.Die eerste stap van RT-PKR is die sintese van 'n DNA/RNA-baster.Omgekeerde transkriptase het ook 'n RNase H-funksie, wat die RNA-gedeelte van die baster afbreek.Die enkelstrengige DNS-molekule word dan voltooi deur die DNS-afhanklike DNS-polimerase-aktiwiteit van die omgekeerde transkriptase na cDNA.Die doeltreffendheid van die eerste-string reaksie kan die amplifikasieproses beïnvloed.Van hier af word die standaard PCR-prosedure gebruik om die cDNA te amplifiseer.Die moontlikheid om RNA na cDNA terug te keer deur RT-PCR het baie voordele, en dit word hoofsaaklik vir geenuitdrukking-analise gebruik.RNA is enkelstrengs en baie onstabiel, wat dit uitdagend maak om mee te werk.Dit dien gewoonlik as 'n eerste stap in qPCR, wat RNA-transkripsies in 'n biologiese monster kwantifiseer.

qPCR en RT-qPCR

Kwantitatiewe PCR (qPCR) word gebruik om nukleïensure vir talle toepassings op te spoor, te karakteriseer en te kwantifiseer.In RT-qPCR word RNA-transkripsies dikwels gekwantifiseer deur dit eers in cDNA om te transkribeer, soos hierbo beskryf, en dan word qPCR daarna uitgevoer.Soos in standaard PCR, word DNA geamplifiseer deur drie herhalende stappe: denaturering, uitgloeiing en verlenging.In qPCR maak fluoresserende etikettering egter die insameling van data moontlik namate PCR vorder.Hierdie tegniek het baie voordele as gevolg van die verskeidenheid metodes en chemie beskikbaar.

In kleurstof-gebaseerde qPCR (tipies groen), laat fluoresserende etikettering die kwantifisering van die geamplifiseerde DNA-molekules toe deur die gebruik van 'n dsDNA-bindende kleurstof.Tydens elke siklus word die fluoressensie gemeet.Die fluoressensiesein neem proporsioneel toe met die hoeveelheid gerepliseerde DNA.Gevolglik word die DNS in "intydse" gekwantifiseer (Fig. 3).Die nadele van kleurstof-gebaseerde qPCR is dat slegs een teiken op 'n slag ondersoek kan word en dat die kleurstof sal bind aan enige ds-DNS wat in die monster teenwoordig is.

In sonde-gebaseerde qPCR kan baie teikens gelyktydig in elke monster opgespoor word, maar dit vereis optimalisering en ontwerp van 'n teikenspesifieke probe(s) wat bykomend tot primers gebruik word.Verskeie tipes sonde-ontwerpe is beskikbaar, maar die mees algemene tipe is 'n hidrolise-sonde, wat 'n fluorofoor en blusmiddel insluit.Fluoresensie-resonansie-energie-oordrag (FRET) verhoed die emissie van die fluorofoor via die quencher terwyl die sonde ongeskonde is.Tydens die PCR-reaksie word die probe egter gehidroliseer tydens primer-verlenging en amplifikasie van die spesifieke volgorde waaraan dit gebind is.Die splitsing van die sonde skei die fluorofoor van die quencher en lei tot 'n amplifikasie-afhanklike toename in fluoressensie (Fig. 4).Dus, die fluoressensie sein van 'n sonde-gebaseerde qPCR reaksie is eweredig aan die hoeveelheid van die sonde teiken volgorde teenwoordig in die monster.Omdat sonde-gebaseerde qPCR meer spesifiek as kleurstof-gebaseerde qPCR is, is dit dikwels die tegnologie wat in qPCR-gebaseerde diagnostiese toetse gebruik word.

Isotermiese versterking

Die PCR-tegnieke wat hierbo genoem word, vereis duur termosiklustoerusting om kamertemperature akkuraat op en af ​​te verhoog vir die denaturasie-, uitgloei- en uitbreidingstappe.'n Aantal tegnieke is ontwikkel wat nie sulke presiese toestelle benodig nie en in 'n eenvoudige waterbad of selfs binne die selle van belang uitgevoer kan word.Hierdie tegnieke word gesamentlik isotermiese versterking genoem en werk gebaseer op eksponensiële, lineêre of kaskade versterking.

Die bekendste tipe isotermiese amplifikasie is lus-gemedieerde isotermiese versterking, of LAMP.LAMP gebruik eksponensiële amplifikasie by 65⁰C om templaat DNA of RNA te amplifiseer.Wanneer LAMP uitgevoer word, word vier tot ses primers komplementêr tot streke van die teiken-DNS gebruik met 'n DNA-polimerase om nuwe DNA te sintetiseer.Twee van hierdie primers het komplimentêre volgordes wat volgordes in die ander primers herken en hulle bind, wat toelaat dat 'n "lus" struktuur in die nuut gesintetiseerde DNA vorm wat dan primer annealing in daaropvolgende rondtes van amplifikasie help.LAMP kan deur verskeie metodes gevisualiseer word, insluitend fluoressensie, agarosegelelektroforese of kolorimetrie.Die gemak om die teenwoordigheid of afwesigheid van produk deur kolorimetrie te visualiseer en op te spoor en die gebrek aan duur toerusting wat benodig word, het LAMP 'n geskikte opsie gemaak vir SARS-CoV-2-toetsing in gebiede waar kliniese laboratoriumtoetsing nie geredelik beskikbaar was nie, of berging en vervoer van monsters nie haalbaar was nie, of in laboratoriums wat nie voorheen PCR-termofietsrytoerusting gehad het nie.