RNase is 'n sensitiewe woord wat baie studente wat dikwels RNA-ekstraksie-eksperimente doen, nie wil hoor nie.Ten volle gewapen is die RNA wat uiteindelik met die hoogs giftige reagense fenol en chloroform onttrek is, afgebreek.Ek is nie versoen nie!!!Kom ons kyk vandag na die oorsprong van die beroemde Rnase.

Ribonuklease (RNase), of RNase, is 'n nuklease wat RNA in klein molekules kan hidroliseer.RNase, as 'n klein molekule proteïen, is buitengewoon stabiel .Konvensionele hoë temperatuur en hoë druk stoom sterilisasie en proteïen inhibeerders kan dit nie heeltemal deaktiveer nie.Die stabiliteit van RNase kom hoofsaaklik van die disulfiedbindings in die struktuur.Byvoorbeeld, die algemeen gebruikte RNase van beespankreas het slegs 124 aminosure, maar bevat 4 disulfiedbindings.Swaelbinding en disulfiedbinding gee RNase uitstekende termiese stabiliteit.Daarbenewens het rnase 'n relatief klein molekulêre gewig en kan dit in baie gevalle vinnig sy oorspronklike konformasie herstel.

Benewens uiters stabiel,RNases is alomteenwoordig in die laboratorium .RNase is 'n biologiese verdedigingsmeganisme.Vir 'n sel is eksogene RNA dikwels dodelik.In vergelyking met eksogene DNA, is eksogene RNA dikwels gevaarliker.RNA word gelukkig getranskribeer en vertaal, so byna alle organismes het RNases ontwikkel om teen die inval van eksogene RNA te verdedig.Daarom straal die bakteriese selle wat in die laboratorium gekweek word en jy wat RNA onttrek die aroma van RNase uit.Menslike liggaamsvloeistowwe (speeksel, trane, ens.) bevat 'n groot hoeveelheid RNase, so moenie huil wanneer RNA afgebreek word nie.Hoe meer jy huil, hoe erger is die RNA-afbraak!!Suster Daiyu is nie geskik vir RNA-ekstraksie nie!

Boonop bevat jou delikate vel ook baie RNase, en die merkers, pipette, yskasdeure en deurhandvatsels wat deur die vel geraak is, bevat ook RNase.

Met soveel gejaag, kom ons kyk hoe om RNases te hanteer.

Die eerste ding waaraan almal dink wanneer RNA verwyder word, isDEPC(diëtielpirokarbonaat).DEPC denatureer hoofsaaklik die proteïen deur te kombineer met die imidasoolring van die RNase aktiewe groep histidien, en daardeur die aktiwiteit van die ensiem inhibeer.0.1% DEPC kan 'n beter verwyderingseffek op Rnase hê, maar ons moet daarop let dat DEPC 'n bekende karsinogeen is, daarom moet spesiale aandag gegee word wanneer dit gebruik word.

Vir RNase moet ons by twee aspekte begin,die eerste is om die aktiwiteit van endogene RNase te inhibeer

Konvensionele RNA ekstraksie reagense soos guanidien isothiocyanate en DTT vervat in Trizol kan die disulfiedbinding van RNase oopmaak, maar daar is steeds 'n paar RNases, veral in weefselmonsters, so let op lae temperatuur.

1.Dompel die weefselmonster onmiddellik in vloeibare stikstof nadat dit uitgehaal is, of in 'n kommersiële RNA-preserveringsoplossing.

2.Nadat die RNA van die selmonster onttrek is, voeg dit by die lise-oplossing en liseer dit op die yskas

3. Dit is die beste om vloeibare stikstof te gebruik vir maal wanneer weefselmonsters gehomogeniseer word.Wanneer 'n elektriese homogeniseerder sonder vloeibare stikstof gebruik word, let daarop om die homogenaatadapter volledig vooraf te verkoel.

Die tweede is eksogene DNase

1.Wees ten volle gewapen, dra 'n laboratoriumjas, dra 'n masker, en maak seker dat jy 'n paar nuwe handskoene dra (moenie so spaarsaam wees nie!! Daar moet kennis geneem word dat Trizol superkorrosief is, en dit is ook baie sterk deur handskoene, so moenie op jou hande drup nie).

2.Al die gebruikte pipetpunte, EP-buise, PCR-buise en ander toerusting moet de-RNase behandel word.Dit kan in 0,1% DEPC geweek word en dan onder hoë druk onder druk geplaas word.Gee aandag aan die operasie in 'n dampkap.Plaaslike tiranne kan direk verbruiksgoedere koop vir die verwydering van ensieme.

NS: Laat ek jou 'n lui metode vertel.Alhoewel hoë temperatuur en hoë druk nie RNase heeltemal kan verwyder nie, sal dit 'n groot deel daarvan verwyder.2 keer van hoë temperatuur en hoë druk het 'n goeie effek, en die ekstraksie van RNA het min effek.

3.Alkohol kan proteïene denatureer,dus kan die RNA-ekstraksietabel met 75% alkohol afgevee word , en handskoene kan ook met alkohol gespuit word.

4.Die finale RNA-oplosoplossing en sentrifugeerbuis moet ook de-RNase behandel word.DEPC-water is 'n algemeen gebruikte RNA-oplosoplossing.Kom ons praat oor die korrekte voorbereidingsmetode van DEPC-water (onthou om die kommersiële DEPC te herverpak wanneer jy dit koop)

Voeg DEPC by ultrasuiwer water teen 1:1000, skud goed, laat staan ​​oornag by 37°C, en steriliseer by 121°C onder hoë temperatuur en hoë druk vir 15 minute.DEPC water kan gestoor word by -20°C in 1 ml aliquots.

Ten slotte, om op te som: lae temperatuur is die sleutel, verbruiksgoedere word goed hanteer, ten volle gewapen en minder praat!

Wel, dit is dit vir vandag se strategie.Ek wens jou al die RNA konsentrasie en suiwerheid toe wat jy genoem het.Beide A260/A280 is 2.0!!!

Natuurlik, as jy 'nkamertemperatuur werking RNA ekstraksie kit, jy mag nie bogenoemde probleme ondervind nie.

Werk by kamertemperatuur, sonder om DNase by te voeg, onttrek totale RNA uit selle in 11 minute, en onttrek totale RNA uit diereweefsel of plante in 30 minute.

Vir proefmonsters, kontak asseblief:overseas@foregene.com

Verwante Produkte:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/