In qPCR-eksperimente is onderlaagontwerp ook 'n baie belangrike skakel.Of die primers geskik is of nie, is nou verwant aan of die amplifikasie doeltreffendheid die standaard bereik, of die geamplifiseerde produkte spesifiek is en of die eksperimentele resultate beskikbaar is.
So hoe om qPCR primer spesifisiteit beter te maak?Hoë versterkingsdoeltreffendheid?
Vandag sal ons jou neem om saam qPCR primers te ontwerp, en laat qPCR primer ontwerp 'n doeltreffende leervaardigheid in eksperimente word.
Wanneer qPCR-inleiders ontwerp word, let gewoonlik op die volgende punte: primers moet so veel as moontlik oor introns ontwerp word, die produklengte moet 100-300 bp wees, die Tm-waarde moet so na as moontlik aan 60°C wees, en die stroomop- en stroomaf-primers moet so na as moontlik wees, en die einde van die primer moet G C of primer wees, ens.
1. Ontwerp van primers wat oor introne strek
Wanneer qPCR-inleiders ontwerp word, kan die keuse van primers wat oor introns ontwerp is, verhoed dat die gDNA-sjabloon geamplifiseer word, en die produkte is almal afgelei van die amplifikasie van cDNA, en sodoende die invloed van gDNA-kontaminasie uitskakel.
2. Onderlaag lengte
Die primerlengte is gewoonlik tussen 18-30 nt, en die lengte van die amplifikasieproduk moet so veel as moontlik tussen 100-300 bp beheer word.
As die onderlaag te kort is, sal dit lei tot nie-spesifieke amplifikasie, en as dit te lank is, sal dit maklik sekondêre struktuur vorm (soos haarnaaldstruktuur).As die amplifikasieproduk te lank is, is dit nie geskik vir die reaksie van polimerase nie, wat die doeltreffendheid van PCR-amplifikasie sal beïnvloed.
3. GC-inhoud en Tm-waarde
Die GC-inhoud van primers moet tussen 40% en 60% beheer word.As dit te hoog of te laag is, is dit nie bevorderlik om die reaksie te begin nie.Die GC-inhoud van die voorwaartse en terugwaartse primers moet naby aan dieselfde wees om dieselfde Tm-waarde en uitgloeitemperatuur te verkry.
Die Tm-waarde moet so ver as moontlik tussen 55-65°C wees, gewoonlik rondom 60°C, en die Tm-waarde van die stroomop en stroomaf moet so na as moontlik wees, verkieslik nie meer as 4°C nie.
4. Vermy die keuse van A aan die 3′ einde van die onderlaag
Wanneer die 3'-punt van die primer nie ooreenstem nie, is daar groot verskille in die sintese-doeltreffendheid van verskillende basisse.Wanneer die laaste basis A is, kan dit ook kettingsintese inisieer selfs in die geval van wanpassing, en wanneer die laaste basis T When is, word die doeltreffendheid van wanpassingsinduksie aansienlik verminder.Probeer dus om A aan die 3′-kant van die onderlaag te kies, en dit is beter om T te kies.
As dit 'n sonde-primer is, kan die 5'-punt van die sonde nie G wees nie, want selfs wanneer 'n enkele G-basis aan die FAM-fluoresserende verslaggewergroep gekoppel is, kan G ook die fluoresserende sein wat deur die FAM-groep uitgestraal word, uitblus, wat lei tot vals negatiewe resultate.Verskyn.
5. Basis verspreiding
Die verspreiding van die vier basisse in die primer is verkieslik ewekansig, en vermy meer as 3 opeenvolgende G of C aan die 3′ einde, en meer as 3 opeenvolgendeG of C is maklik om paring in die GC-ryke volgordestreek te genereer.
6. Die onderlaagontwerpgebied moet komplekse sekondêre strukture vermy.
Die sekondêre struktuur wat deur die enkele string van die amplifikasieproduk gevorm word, sal die gladde vordering van PCR beïnvloed.Deur vooraf te voorspel of daar 'n sekondêre struktuur in die teikenvolgorde is, probeer om hierdie gebied in die ontwerp van primers te vermy.
7. Die primers self en tussen die primers moet probeer om opeenvolgende komplementêre basisse te vermy.
Daar kan geen opeenvolgende 4-basis-komplementariteit tussen die primer self en die primer wees nie.Die onderlaag self moet nie 'n komplementêre volgorde hê nie, anders sal dit self vou om 'n haarnaaldstruktuur te vorm, wat die uitgloeikombinasie van die onderlaag en die sjabloon sal beïnvloed.
Komplementêre volgordes kan nie tussen stroomop en stroomaf primers bestaan ​​nie.Komplementariteit tussen primers sal primer dimers produseer, wat PCR doeltreffendheid sal verminder en selfs kwantitatiewe akkuraatheid sal beïnvloed.As die onderlaag-dimeer- en haarnaaldstrukture onvermydelik is, moet die △G-waarde nie te hoog wees nie (behoort minder as 4,5 kcal/mol te wees).
8. Die primers versterk die teiken spesifieke produk.
Die uiteindelike doel van qPCR-opsporing is om die oorvloed van die teikengeen te verstaan.Indien nie-spesifieke amplifikasie plaasvind, sal die kwantifisering onakkuraat wees.Daarom, nadat die primers ontwerp is, moet hulle deur BLAST getoets word, en die spesifisiteit van die produkte word vergelyk in die volgorde databasis.
Vervolgens neem ons die menslike GAS6 (Growth arrest specific 6) geen as 'n voorbeeld om qPCR primers te ontwerp.
01 navraag geen
Homo GAS6deur NCBI.Hier moet ons aandag gee aan die vergelyking van die geennaam en spesies om te verseker dat hulle konsekwent is.
02 Vind die geenvolgorde
(1) As die teikenvolgorde genomiese DNA is, kies die eerste een, wat die genomiese DNA-volgorde van die geen is.
(2) As die teikenvolgorde mRNA is, kies die tweede een.Nadat u ingegaan het, klik "CDS" in die tabel hieronder.Die bruin agtergrondvolgorde is die koderende volgorde van die geen.
03 Ontwerp onderlaag
Voer die Primer-BLAST-koppelvlak in
Tik die geenvolgordenommer of die volgorde in Fasta-formaat links bo, en vul die relevante parameters in.

Klik op "Kry primers" en NCBI sal opduik om jou te vertel dat so 'n parameterkeuse na ander splitsingsvariante versterk sal word.Ons kan die verskillende splitsingsvariante nagaan en dit indien om die toepaslike onderlaagpaar te kry (soos in die figuur hieronder getoon).Hierdie proses kan tien sekondes neem om uit te voer.
Die uitgloeiingstemperature van hierdie onderlaagpare is almal rondom 60°C.Volgens die doel van die eksperiment, kies primers met matige lengte, goeie spesifisiteit en minder self-komplementering van die primers vir die eksperiment, en die suksessyfer is redelik hoog!
04Primer spesifisiteit verifikasie
Trouens, benewens die ontwerp van primers, kan Primer-Blast ook die primers evalueer wat ons self ontwerp het.Keer terug na die onderlaagontwerpbladsy, voer die stroomop- en stroomafonderlaag in wat ons ontwerp het, en ander parameters sal nie aangepas word nie.Nadat u ingedien het, kan u sien of die primerspaar ook op ander gene bestaan.As almal van hulle vertoon word op die geen wat ons wil versterk , wat aandui dat die spesifisiteit van hierdie paar primers groot is!(Dit is byvoorbeeld die enigste resultaat van die primer-navraag!)

05 Primer kwaliteit oordeel
Watter soort onderlaag is die "perfekte" onderlaag wat "versterkingsdoeltreffendheid tot standaard", "versterkte produkeienskappe" en "betroubare eksperimentele resultate" kombineer?
Amplifikasie doeltreffendheid

smeltkurwe
Die amplifikasie doeltreffendheid van die primers bereik 90%-110%, wat beteken dat die amplifikasie doeltreffendheid goed is, en die smeltkurwe het 'n enkele piek en gewoonlik Tm>80°C, wat beteken dat die amplifikasie spesifisiteit goed is.
 
Verwante Produkte:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman