Real Time PCR, ook bekend as kwantitatiewe PCR of qPCR, is 'n metode vir intydse monitering en ontleding van PCR amplifikasie produkte.
Omdat kwantitatiewe PCR die voordele van eenvoudige werking, vinnig en gerieflik, hoë sensitiwiteit, goeie herhaalbaarheid en lae kontaminasietempo inhou, word dit wyd gebruik in mediese toetsing, geneesmiddeldoeltreffendheidbeoordeling, geenuitdrukkingnavorsing, transgeniese navorsing, geenopsporing, patogeenopsporing, dier- en plantopsporing., voedseltoetsing en ander velde.
Dus, of jy nou besig is met basiese navorsing in lewenswetenskappe, of werknemers van farmaseutiese maatskappye, veeteeltmaatskappye, voedselmaatskappye, of selfs werknemers van intree-uittree-inspeksie- en kwarantynburo's, omgewingsmoniteringsafdelings, hospitale en ander eenhede, sal jy min of meer blootgestel word aan Of jy moet die kennis van die bemeestering van kwantitatiewe PCR ken.

Beginsel van Real Time PCR

Intydse PCR is 'n metode waarin fluoresserende stowwe by die PCR-reaksiestelsel gevoeg word, en die fluoressensieseinintensiteit in die proses van PCR-reaksie intyds gemonitor word deur 'n kwantitatiewe PCR-instrument, en uiteindelik word die eksperimentele data ontleed en verwerk.

【Versterkingskurwe】is die kurwe wat die dinamiese proses van PCR beskryf.Die amplifikasiekurwe van PCR is nie eintlik 'n standaard eksponensiële kurwe nie, maar 'n sigmoïedkromme.

[Platformfase van versterkingskromme]Met die toename van die aantal PCR-siklusse, die inaktivering van DNA-polimerase, die uitputting van dNTP's en primers, en die inhibisie van die sintesereaksie deur die reaksie neweproduk pirofosfaat, ens., brei die PCR nie altyd eksponensieel uit nie., en sal uiteindelik 'n plato betree.

[Eksponensiële Groei Streek van Amplifikasie Curve]Alhoewel die platofase baie verskil, is die herhaalbaarheid in 'n sekere streek van die eksponensiële groeigebied van die amplifikasiekurwe baie goed, wat baie belangrik is vir kwantitatiewe analise van PCR.

[Drumpelwaarde en Ct-waarde]Ons stel die limietwaarde van fluoressensie-opsporing op die toepaslike posisie in die eksponensiële groeiarea van die amplifikasiekurwe, naamlik die drempelwaarde (Drempel).Die snypunt van die drempelwaarde en die versterkingskromme is die Ct-waarde, dit wil sê, die Ct-waarde verwys na die aantal siklusse (Threshold Cycle) wanneer die drempelwaarde bereik word.

Die grafiek hieronder toon duidelik die verband tussen drempellyn en versterkingskurwe, drempel en Ct-waarde.

【Hoe om te kwantifiseer?】

Dit is deur wiskundige teorie bewys dat die Ct-waarde 'n omgekeerde lineêre verwantskap het met die logaritme van die aantal aanvanklike sjablone.Real Time PCR monitor PCR amplifikasie produkte in reële tyd en kwantifiseer dit tydens die eksponensiële amplifikasie fase.

Vir elke siklus van PCR het die DNA eksponensieel met 2 keer toegeneem, en het gou 'n plato bereik.

Aanvaar dat die hoeveelheid begin-DNS A is₀ , na n siklusse, kan die teoretiese hoeveelheid DNA-produk uitgedruk word as:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Dan, hoe meer die aanvanklike DNA-hoeveelheid A 0 is, hoe gouer bereik die hoeveelheid van die geamplifiseerde produk die opsporingswaarde An, en die aantal siklusse wanneer An bereik word, is die Ct-waarde.Dit wil sê, hoe meer die aanvanklike DNS-hoeveelheid A 0 is, hoe vroeër bereik die amplifikasiekurwe pieke, en hoe dienooreenkomstig is die vereiste aantal siklusse n kleiner.

Ons voer gradiëntverdunning uit van die standaard van bekende konsentrasie en gebruik dit as 'n sjabloon vir Real Time PCR, en 'n reeks amplifikasiekrommes sal met gelyke intervalle verkry word in die volgorde van die begin-DNS-hoeveelheid van meer na minder.Volgens die lineêre verband tussen die Ct-waarde en die logaritme van die aantal beginsjablone, a[standaardkurwe] kan geskep word.

Deur die Ct-waarde van die monster met onbekende konsentrasie in die standaardkurwe te vervang, kan die aanvanklike sjabloonhoeveelheid van die monster met onbekende konsentrasie verkry word, wat die kwantitatiewe beginsel van Real Time PCR is.

Opsporing metode van Real Time PCR

Real Time PCR bespeur PCR amplifikasie produkte deur die fluoressensie intensiteit in die reaksie sisteem op te spoor.

Beginsel van Fluorescent Dye Inbedding Metode】

Fluorescerende kleurstowwe, soos TB Green ® , kan nie-spesifiek aan dubbelstring DNA in PCR-stelsels bind en fluoresseer na binding.

Die fluoressensie-intensiteit in die reaksiesisteem het eksponensieel toegeneem met die toename van PCR-siklusse.Deur die fluoressensie-intensiteit op te spoor, kan die hoeveelheid DNA-amplifikasie in die reaksiesisteem intyds gemonitor word, en dan kan die hoeveelheid van die beginsjabloon in die monster omgekeerd beraam word.

【Beginsel van fluoresserende sonde metode】

fluoresserende sondeis 'n nukleïensuurvolgorde met 'n fluoresserende groep aan die 5'-punt en 'n blusgroep aan die 3'-punt, wat spesifiek aan die sjabloon kan bind.Wanneer die sonde ongeskonde is, word die fluoressensie wat deur die fluorofoor uitgestraal word deur die blusgroep geblus en kan dit nie fluoresseer nie.Wanneer die sonde ontbind word, sal die fluoresserende stof dissosieer en fluoressensie uitstraal.

'n Fluorescerende sonde word by die PCR-reaksieoplossing gevoeg.Tydens die uitgloeiproses sal die fluoresserende sonde aan die spesifieke posisie van die sjabloon bind.Tydens die verlengingsproses kan die 5′→3′-eksonuklease-aktiwiteit van die PCR-ensiem die fluoresserende sonde wat met die sjabloon gehibridiseer is, ontbind, en die fluoresserende stof word gedissosieer om fluoressensie uit te straal.Deur die fluoressensie-intensiteit van die sonde in die reaksiestelsel op te spoor, kan die doel van die monitering van die amplifikasiehoeveelheid van die PCR-produk bereik word.

【Seleksie van fluoressensie-opsporingsmetode】

As dit gebruik word om volgordes met hoë homologie te onderskei en multipleks PCR-opsporing uit te voer, soos SNP-tikanalise, is die fluoresserende sondemetode onvervangbaar.
Vir ander Real Time PCR-eksperimente kan 'n eenvoudige, maklike en laekoste-fluoresserende chimera-metode gebruik word.

probes Sterk spesifisiteit, in staat tot multipleks PCR

Tekortkoming

Hoë spesifisiteitsvereistes vir versterking;

multipleks PCR kan nie uitgevoer word nie. Moet spesifieke probes ontwerp, hoë koste;

soms is sondeontwerp moeilik

Verwante Produkte: