RT-qPCR is die basiese eksperiment van molekulêre biologie, en almal moet daarmee vertroud wees.Dit sluit hoofsaaklik drie stappe in: RNA-ekstraksie, omgekeerde transkripsie na cDNA, en intydse fluoresserende kwantitatiewe PCR.Dit help nie, wat gaan aan?Dit is waarskynlik dat daar 'n probleem metdie omgekeerde transkripsie-eksperiment!Alhoewel dit blyk dat die omgekeerde transkripsie-eksperiment slegs RNA, dNTP, primers enomgekeerde transkripsiena die sentrifugebuis en meng goed, maar in die werklike werkingsproses is daar nog baie besonderhede waaraan aandag gegee moet word.Kom ons leer daaroor!

Hoe om die kwaliteit van RNA te beoordeel?
Om cDNA te verkry, is die kwaliteit van RNA van kritieke belang!RNA-kwaliteit kan hoofsaaklik uit twee aspekte opgespoor word:
(1) RNA-integriteit:RNA-integriteit kan geverifieer word deur agarosegelelektroforese. Neem eukariote as voorbeeld, die volledige totale RNA het drie duidelike bande, die molekulêre gewigte van groot na klein is 28S, 18S en 5S, en 28S is twee keer so helder soos 18S;as drie bande gesien kan word, maar die bandtipe is vaag of Diffusie beteken dat die RNA gedeeltelik afgebreek is.Voer asseblief dadelik die omgekeerde transkripsie-reaksie uit op hierdie tydstip en verhoog die sjablooninvoer gepas;as slegs 'n band met 'n klein molekulêre gewig of geen band gesien kan word nie, is die RNA heeltemal afgebreek en moet dit weer onttrek word.Agilent 2100 dui die integriteit van RNA aan met piekdiagram en RIN-waarde.As die nukleïensuur ongeskonde is, is die basislyn van die elektroferogram plat;as die nukleïensuur ernstig afgebreek word, is die basislyn ongelyk en kom meer afbraakpieke voor;die waarde van RIN weerspieël die integriteit van die RNA, binne die reeks van 0-10, hoe groter die waarde, hoe beter is die kwaliteit van die RNA.Wel, hoe hoër die graad van volledigheid.
(2) Suiwerheid van RNA:Die verhouding van OD260/280 kan deur UV-spektrofotometrie opgespoor word.As die verhouding van OD260/280 tussen 1,9 en 2,1 is, is die suiwerheid baie goed.
Residuele genomiese DNA kan lei tot onakkurate kwantitatiewe resultate
Wanneer RNA onttrek word, kan die RNA wat ons kry gemeng word met genomiese DNA (gDNA) wat nie skoongemaak is nie.Daarom sal die cDNA na omgekeerde transkripsie ook gemeng word metgDNA.Tydens die stroomafqPCRreaksie,cDNAen gDNA kan gelyktydig geamplifiseer word, wat lei tot 'n relatief klein CT-waarde, dus kan die resultate bevooroordeeld wees.
So wat moet ons doen in hierdie situasie?Voorgenestel voor:
(1) Voer genoomskoonmaak op die omgekeerde RNA uit, wat deur kolomekstraksie tydens RNA-ekstraksie verwyder kan word;
(2) Behandel die onttrekte RNA met DNaseI , maar beëindig dit met EDTA;
van omgekeerde transkripsie reagensemet genoom skoonmaak modules;

Hoe om primers te kies vir omgekeerde transkripsie?
Omgekeerde transkripsie primers beïnvloed ook die uitkoms van die omgekeerde transkripsie reaksie.U kan ewekansige primers, Oligo dT of geenspesifieke primers kies vir omgekeerde transkripsie volgens die spesifieke omstandighede van die eksperiment:
(1) Spesifieke transkripsies: geen-spesifieke primers word aanbeveel;
(2) Lang fragment transkripsies: Oligo dT/geen-spesifieke primers word aanbeveel;
(3) Interne fragmente van langsegment-transkripsies: geen-spesifieke primers/ ewekansige primers /random primers + Oligo dT.As die daaropvolgende qPCR-eksperiment uitgevoer word, kan Oligo dT nie alleen gebruik word nie, want die gebruik van Oligo dT alleen kan 3′-eind-vooroordeel veroorsaak, wat lei tot onakkurate qPCR-eksperimentresultate;
(4) miRNA: Stam-lus primers of tailing primers kan gebruik word.

Hoeveel keer moet die omgekeerde transkripsieproduk cDNA verdun word vir kwantifisering?
Nadat die cDNA van die omgekeerde transkripsieproduk verkry is, is hoeveel keer die cDNA vir qPCR-eksperimente verdun moet word, baie belangrik.As die cDNA-konsentrasie te hoog of te laag is, kan die amplifikasie-doeltreffendheid beïnvloed word.Kan die cDNA-konsentrasie gemeet word, en hoe moet dit gedoen word?
(1) Die cDNA-konsentrasie van die omgekeerde transkripsieproduk kan nie gemeet word nie, want benewens die cDNA-produk bevat die omgekeerde transkripsieproduk ook omgekeerde transkripsie-residubuffer, omgekeerde transkripsie, primers, ens., wat sal inmeng met die konsentrasiemetingsresultate en veroorsaak dat OD260/280, OD260/DNA nie waar is nie en dus nie cD260-verhouding weerspieël nie.Op hierdie tydstip sal sommige vriende sê, dan sal ek die konsentrasie meet na suiwering;Hier wil Foregene daaraan herinner dat die cDNA nie aanbeveel word om gesuiwer te word nie, omdat die lengte van die cDNA wat deur die omkering verkry word verskillend is, en die kort cDNA sal verlore gaan tydens die suiwering.
(2) So wat om te doen?Voor die qPCR-eksperiment kan die verdunningsgradiënt van die cDNA deur die voor-eksperiment bepaal word.Byvoorbeeld: gebruik cDNA-voorraadoplossing, 10-voudige verdunning en 100-voudige verdunning as sjablone vir qPCR-eksperimente, en kies die verdunningsfaktor met 'n CT-waarde in die reeks van 18-28.

Hoe moet miRNA's omgekeerd getranskribeer word?
miRNA is 'n enkelstrengige klein molekule RNA met 'n grootte van ongeveer 22 nt wat nie vir proteïen kodeer nie.As gevolg van sy kort lengte, konvensionele qPCR metode is moeilik om dit direk te kwantifiseer, so dit is dikwels nodig om miRNA uit te brei;die algemeen gebruikte omgekeerde transkripsiemetodes vir miRNA sluit stamlusmetode en stertmetode in.
Die stam-lus metode is om die miRNA uit te brei deur stam-lus primers by te voeg.Hierdie opsporing metode het hoër sensitiwiteit en spesifisiteit, maar die opsporing deurset is laag.Een omgekeerde transkripsie kan net een miRNA en 'n interne verwysing opspoor;die stertbyvoegingsmetode is saamgestel uit twee Dit word voltooi deur die gesamentlike werking van twee ensieme, wat PolyA-polimerase en omgekeerde transkripsie is.PolyA-polimerase is verantwoordelik vir die toevoeging van PolyA-sterte by miRNA om sy lengte te vergroot, en omgekeerde transkripsie voer omgekeerde transkripsie-reaksie uit.Hierdie metode het 'n hoë opsporing deurset en kan verskeie miRNAs en interne verwysings in een omgekeerde transkripsie opspoor, maar die sensitiwiteit en spesifisiteit is laag in die stam-lus metode.