Almal praat oor die beginsel van qRT-PCR-eksperiment, primerontwerp, resultaatinterpretasie, ens., maar ek dink ek moet die eksperimentele werking van qRT-PCR met jou deel.Dit is klein, maar dit gaan oor resultate.
Voordat ons qRT-PCR doen, moet ons 'n duidelike begrip hê van ons eie RNA en operasiemetodes.Ons pogings is immers daarop gemik om resultate te kry, eerder as om bloot te oefen.Dus, voordat ons qRT-PCR doen, moet ons die volgende kwessies bepaal (waarvan sommige slegs van toepassing is op SYBR).
1 Is jy seker jou RNA is nie afgebreek nie?
NanoDrop 2000 kan slegs die konsentrasie en suiwerheid van RNA opspoor, maar kan nie die integriteit van RNA opspoor nie.
Die RNA (RNA-intensiteitsnommer) waarde kan die integriteit van die RNA weerspieël, wat deur die Agilent 2100 Bioanalyzer-stelsel opgespoor word.
Fig. Skematiese diagram van RIN-waardes vir verskillende RNA-monsters (eukariote)
Laboratoria het egter oor die algemeen nie Agilent 2100 Bioanalyzer nie.In hierdie geval kan ons deur formaldehiedgel opspoor, maar die vereiste vir die totale hoeveelheid RNA is hoog, dus die vinnigste metode is om gewone gelelektroforese te gebruik.Dit word vereis om in 'n nukleasevrye omgewing te wees, daarom is dit nodig om die elektroforesetenk, solbottel, gelbeugel en kam met DEPC-water te spoel.Die agarose is ook nukleasevry (solank dit vars oopgemaak is), en die laaibuffer moet so veel as moontlik vars oopgemaak word, met 1,2% gel.
Let daarop dat die jel heeltemal opgelos moet word, anders sal dit inhomogene bande veroorsaak, soos getoon in monster 9 in die figuur.As die spanning te hoog is of te lank loop, sal dit hitte genereer en RNA-degradasie veroorsaak, dus moet die spanning en tyd redelik beheer word.Boonop kan gelloop ook verder bepaal of daar DNS-residu in die monster is, en waarneem of daar 'n groot aantal behoue bande in die doseerput is.
Figuur.Gelelektroforese opsporing van RNA
2 Is jy seker oor die konsentrasie van jou cDNA?
Die ervaring van die groot broers in die laboratorium is dat die cDNA van die 20 ul-stelsel wat deur elke inversie verkry word, direk 20X verdun word, terwyl die postdoktorale susters 10X verdun word.Ek is gewoonlik afhanklik van die situasie.Omdat die kwaliteit van die RNA wat deur elke persoon genoem word verskillend is, is die vlak van omkering ook anders, en die omkeertegnologie is dalk nie stabiel nie.
So elke keer as ek die omgekeerde cDNA kry, sal ek dit eers so 3 keer verdun, en dan die huishouding geen gebruik om RT-PCR te doen, die aantal siklusse is oor die algemeen 25 siklusse, om die spesifieke konsentrasie te identifiseer, en dan die finale verdunningsfaktor te bepaal.
3 Is jy seker jou primers is maklik om te gebruik?
Dit kan die smeltkurwe van qRT-PCR slaag, maar dit kos steeds geld.Vir laboratoriums sonder baie geld, wanneer hulle baie primers kry, kan hulle gewone RT-PCR gebruik om te sien of dit 'n enkele band is en die spesifisiteit van die primers te identifiseer.As die laboratorium nie geld kort nie, kan die spesifisiteit van alle primers een keer deur die smeltkurwe geïdentifiseer word.
4 Is jy seker dat jou eksperimentele toestande geskik is?
SYBR moet teen sterk lig beskerm word, so probeer om die oorhoofse lig af te skakel wanneer SYBR-reagens bygevoeg word, en hoef slegs dowwe lig te gebruik om dit te voltooi.
Berg SYBR by 4°C.Wanneer in gebruik, draai liggies op en af om goed te meng om skuim te voorkom, en moenie kragtig draai nie.
Sommige jonger susters hou daarvan om merke op die PCR-bord te teken uit vrees dat hulle die monsters sal meng, wat verkeerd is.Omdat jou merkers heel waarskynlik die versameling van fluoresserende seine sal beïnvloed, beveel ek gewoonlik juniors aan om eksperimentele notaboeke te gebruik om te help met geheue, soos hieronder getoon.
Figuur.qRT-PCR monster laai diagram
5 Is jy seker jy doen dit reg?
Maak seker dat jy handskoene dra, handskoene dra, handskoene dra en drie keer belangrike dinge sê.
Om die blootstelling van SYBR aan lig te verminder, wil ek persoonlik eers 'n sjabloon byvoeg, soos in die figuur hieronder getoon.Volgens ondervinding sal die byvoeging van 'n klein hoeveelheid sjabloon waarskynlik steekproeffoute veroorsaak.Daarom, om die fout wat veroorsaak word deur 'n klein hoeveelheid sjabloon by te voeg, te verminder, verdubbel ek gewoonlik weer die monster en verdubbel die hoeveelheid wanneer die monster bygevoeg word om die hoeveelheid H2O2 wat bygevoeg word te verminder.
Figuur.Skematiese diagram van qRT-PCR laai
Stel dan die qRT-PCR-stelsel soos volg op.
Figuur.qRT-PCR stelsel voorbereiding diagram
LET WEL: Die konfigurasieproses moet op ys gedoen word.
Nadat die monster bygevoeg is, plak die deursigtige seëlfilm.Probeer om nie die oppervlak van die deursigtige seëlfilm met jou hande aan te raak nie, werk net vanuit die spasie aan beide kante van die film.Omdat vingerafdrukke ook die versameling van fluoresserende seine kan beïnvloed.Gebruik dan 'n sentrifugeer om vinnig vir 10 s teen lae spoed te sentrifugeer om te verhoed dat die monster aan die muur hang.
Verwante Produkte:
Postyd: 28-Apr-2023
