Spesifisiteit van opsporing
In die meeste gevalle is die doel van onderlaagontwerp om die spesifisiteit van PCR te maksimeer.Dit word bepaal deur die min of meer voorspelbare invloed van baie veranderlikes.Een belangrike veranderlike is die volgorde aan die 3'-punt van die primer.
Wat belangrik is, is dat PCR-toetse wat ontwerp is vir spesifisiteit meer geneig is om hoë doeltreffendheid oor 'n wye dinamiese reeks te handhaaf, omdat die toets nie nie-spesifieke amplifikasieprodukte produseer nie, en daardeur kompeteer met PCR-reagense of die hoofamplifikasiereaksie inhibeer.
Natuurlik, in sommige gevalle is spesifisiteit nie die belangrikste nie, byvoorbeeld wanneer die doel is om naverwante te kwantifiseer, maar verskillende patogene, spesiale ontwerp, optimalisering en verifikasiestandaarde word vereis.
Die smeltkurwe is 'n standaardmetode om die spesifisiteit van amplikone te bepaal, ten minste in terme van of 'n enkele teiken versterk moet word.Dit moet egter beklemtoon word dat die smeltkurwes misleidend kan wees omdat dit byvoorbeeld beïnvloed kan word deur die gekombineerde effekte van suboptimale primers en lae templaatkonsentrasies.
P5 |Die smeltkurwe toon die Tm-verskuiwings wat verkry word vanaf twee opsporings van verskillende hoeveelhede van twee teiken-DNS'e.
A. By hoër konsentrasies (ad)) is daar geen duidelike primer dimeer nadat die qPCR meting voltooi is nie.Soos die sjabloonkonsentrasie afneem tot 50 kopieë (e), begin 'n nie-spesifieke produk verskyn en word dit die enigste produk met die laagste konsentrasie (f).
B. Die toets het dieselfde Tms by alle teikenkonsentrasies aangeteken, en daar was geen duidelike primer dimeer nie, selfs by die laagste konsentrasie (5 kopieë).By die gebruik van hierdie twee opsporingsmetodes is geen amplifikasieprodukte in NTC's opgespoor nie.
P5 toon die oplossingskurwes wat verkry is met monsters waarin die sjabloon by verskillende konsentrasies teenwoordig is.P 5a toon dat by die twee laagste konsentrasies, die Tms van die nie-spesifieke amplifikasieprodukte wat geproduseer word, laer is as dié van die spesifieke amplikone.
Uiteraard kan hierdie opsporingsmetode nie betroubaar gebruik word om teikens wat in lae konsentrasies bestaan, op te spoor nie.
Interessant genoeg het NTC's, dws monsters met geen DNA glad nie, nie (nie-spesifieke) amplifikasieprodukte aangeteken nie, wat aandui dat agtergrondgenomiese DNA kan deelneem aan nie-spesifieke amplifikasie/polimerisasie.
Soms kan sulke agtergrondinleiders en nie-spesifieke amplifikasie nie reggestel word nie, maar dit is dikwels moontlik om 'n opsporingsmetode te ontwerp wat nie nie-spesifieke amplifikasie in enige templaatkonsentrasie en NTC (P 5b) het nie.
Hier sal selfs die opname van die versterking van die teikenkonsentrasie met 'n Cq van 35 'n spesifieke ontbindingskurwe produseer.Net so het NTC's geen tekens van nie-spesifieke amplifikasie getoon nie.Soms kan die opsporingsgedrag afhanklik wees van die moederlook, en slegs nie-spesifieke amplifikasie word in sekere buffersamestellings opgespoor, wat verband hou met verskillende Mg2+ konsentrasies.
Stabiliteit van opsporing
Die optimalisering van Ta is 'n nuttige stap in die empiriese verifikasie- en optimaliseringsproses van qPCR-opsporing.Dit verskaf 'n direkte aanduiding van die robuustheid van die primer-stel deur die temperatuur (of temperatuurreeks) te wys wat die laagste Cq produseer sonder om die NTC te versterk.
Die twee tot viervoudige verskil in sensitiwiteit is dalk nie belangrik vir mense met hoë mRNA-uitdrukking nie, maar vir diagnostiese toetse kan dit die verskil tussen positiewe en vals negatiewe resultate beteken.
Die Ta-eienskappe van qPCR-inleiders kan baie verskil.Sommige toetse is nie baie robuust nie, en as hulle nie onder die optimale Ta-waarde van die primers uitgevoer word nie, sal hulle vinnig ineenstort.
Dit is belangrik omdat hierdie tipe opsporing dikwels problematies is in die werklike wêreld, en die suiwerheid van die monster, die konsentrasie van DNS of die teenwoordigheid van ander DNS is dalk nie optimaal nie.
Daarbenewens kan die teikenkopiegetal in 'n wye reeks verskil, en die reagense, plastiekgereedskap of instrumente kan verskil van dié wat gebruik word wanneer die toets opgestel word.
P6|Die temperatuurgradiënt toon die verskillende robuustheid van PCR-opsporing.
A. Gebruik Bioline se Sensifast SYBR-meestermengsel (katalogusnommer BIO-98050) om PCR uit te voer op cDNA wat van menslike brein-RNA voorberei is.
B. Gebruik Bio-Rad se CFX qPCR-instrument om die versterkingskaart en dissolusiekromme van apaleen aan te teken (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Amplifikasiegrafiek en smeltkurwe van ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Amplifikasiegrafiek en ontbindingskurwe van GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs aangeteken by verskillende uitgloeiingstemperature, wat die verskil in Cq aangeteken onder 'n 7C temperatuurgradiënt toon.
P 6 toon 'n tipiese resultaat van 'n ongewenste toets, waar qPCR uitgevoer is met behulp van 'n gradiënt Tas tussen 59C en 67C (P 6a), deur gebruik te maak van primers vir drie menslike brein-spesifieke gene.
Dit kan gesien word uit die amplifikasiegrafiek dat Opalin-inleiders ver van ideaal is omdat hul optimale Ta-reeks baie smal is (Figuur 6b), dit wil sê, Cqs is wyd verspreid, wat daartoe lei dat Cqs aansienlik vergelyk word met hul optimale Cqs Lae.
Hierdie opsporingsmetode is onstabiel en kan lei tot suboptimale versterking.Daarom moet hierdie primers herontwerp word.Daarbenewens toon die smeltkurwe-analise (inlas) dat die spesifisiteit van hierdie opsporingsmetode ook problematies kan wees, omdat die smeltkurwe van elke Ta verskillend is.
Die ACSBG1-opsporingsmetode wat in P 6c getoon word, is meer robuust as die Opalin-opsporingsmetode hierbo, maar dit is nog ver van ideaal, en dit is waarskynlik dat dit verbeter kan word.
Ons beklemtoon egter dat daar geen noodsaaklike verband tussen robuustheid en spesifisiteit is nie, want die ontbindingskurwe wat deur hierdie opsporingsmetode geproduseer word, toon dieselfde piekwaarde in alle Tas (inlas).
Aan die ander kant is die robuustheidstoets baie meer verdraagsaam, en produseer soortgelyke Cqs in 'n wye reeks Tas, soos in die GFAP-toets wat in P 6d gewys word.
Die verskil in Cqs wat in dieselfde 8 grade Celsius-reeks verkry word, is minder as 1, en die oploskromme (inlas) bevestig die opsporingskenmerke in hierdie temperatuurreeks.Dit is opmerklik dat die berekende Tas en die werklike Ta-reeks baie verskillend kan wees.
Daar is baie riglyne wat ontwerp is om navorsers te help om doeltreffende primers te ontwerp, waarvan die meeste op lang gevestigde reëls gebaseer is en baie aandag is aan die 3'-punt van die primers gegee.Dit word dikwels aanbeveel om 'n G of C aan die 3'-kant en twee G- of C-basisse (GC-klem) in te sluit, maar nie meer as twee van die laaste 5 basisse nie.
In die praktyk kan hierdie reëls navorsers lei, maar dit is nie noodwendig onder alle omstandighede korrek nie.
P7 |Die 3'-punt van die onderlaag het min effek op spesifisiteit of doeltreffendheid.
A. Die posisie van die primers vir die menslike HIF-1α (NM_181054.2) geen.
B. Gebruik Agilent Brilliant III SYBR Groen moederdrank (Kat. No. 600882) om ses toetsitems te versterk.
C. Amplifikasiegrafiek en smeltkurwe aangeteken deur Bio-Rad se CFX qPCR instrument en 3'end primers.NTC's word in rooi getoon.
D. Cqs rekord van elke toetsitem
Byvoorbeeld, die resultaat in P 7 weerspreek die 3'end-reël.Alle ontwerpe lewer basies dieselfde resultate, met slegs twee primerkombinasies wat lei tot nie-spesifieke amplifikasie in NTC.
Ons kan egter nie die effek van die GC-knipsel ondersteun nie, want in hierdie geval verminder die gebruik van A of T as 'n maksimum van 30 basisse nie spesifisiteit nie.
Toets C, waar die F-primer in GGCC eindig, het wel Cq's in NTC's aangeteken, wat aandui dat 'n mens dalk hierdie rye aan die 30-punt wil vermy.Ons beklemtoon dat die enigste manier om die beste 3'end-volgorde van 'n primerpaar te bepaal, is om 'n paar kandidaat primers eksperimenteel te evalueer.
Amplifikasie doeltreffendheid
Dit is belangrik dat alhoewel nie-spesifieke PKR-opsporing nooit spesifiek kan word nie, kan die amplifikasie-doeltreffendheid op baie verskillende maniere aangepas en gemaksimeer word deur die ensiem, moederdrank, bymiddels en siklustoestande te verander.
Om die doeltreffendheid van PKR-opsporing te evalueer, is dit die beste om 'n reeksverdunning van 10 of 5 keer die teikennukleïensuur te gebruik, dit wil sê die "standaardkurwemetode".
As PCR-amplikone of sintetiese DNA-teikens gebruik word om 'n standaardkromme te genereer, moet reeksverdunnings van hierdie teikens met 'n konstante hoeveelheid agtergrond-DNS (soos genomiese DNA) gemeng word.
P8 |Verdunningskurwe om die doeltreffendheid van PCR te evalueer.
A. Gebruik primers vir HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA en R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC en Agilent se Brilliant III SYBR Green mastermix (katalogusnommer 600882) vir PCR en smeltkurwe toestande.
B. 100 ng RNA is omgekeerd getranskribeer, 2 keer verdun, en serie-verdunde cDNA-monsters is 5 keer verdun tot 1 ng menslike genomiese DNA.Die smeltkurwe word in die inlas getoon.
C. Die RT-reaksie, verdunning en reeksverdunning is herhaal vir die tweede cDNA-monster, en die resultate was soortgelyk.
P 8 toon twee standaardkrommes, met dieselfde opsporingsmetode op twee verskillende cDNA-monsters, die resultaat is dieselfde doeltreffendheid, ongeveer 100%, en die R2-waarde is ook soortgelyk, dit wil sê die mate van passing tussen die eksperimentele data en die regressielyn of die data Graad van lineariteit.
Die twee standaardkurwes is vergelykbaar, maar nie presies dieselfde nie.Indien die doel is om die teiken akkuraat te kwantifiseer, moet daarop gelet word dat dit onaanvaarbaar is om 'n kopiegetalberekening te verskaf sonder om die onsekerheid te verduidelik
P9 |Meting onsekerheid wat verband hou met kwantifisering deur gebruik te maak van 'n standaardkromme.
A. Gebruik primers vir GAPDH (NM_002046) om PCR en smeltkurwe toestande uit te voer.F: ACAGTTGCCATGTAGACC en R: TAACTGGTTGAGCACAGG en Bioline se Sensifast SYBR-meestermengsel (katalogusnommer BIO-98050).
B. Versterkingskaart, smeltkurwe en standaardkurwe aangeteken met Bio-Rad se CFX qPCR-instrument.
C. Standaardkrommegrafiek en 95% vertrouensinterval (CI).
D. Die kopiegetal en 95% vertrouensinterval van die drie Cq-waardes afgelei van die verdunningskurwe.
P 9 toon dat vir 'n geoptimaliseerde toets, die inherente veranderlikheid van 'n enkele standaardkromme ongeveer 2 keer is (95% vertrouensinterval, minimum tot maksimum), wat die kleinste veranderlikheid kan wees wat verwag kan word.
Verwante produk:
Postyd: 30-Sep-2021
