RT-qPCR is ontwikkel uit gewone PCR-tegnologie.Dit voeg fluoresserende chemikalieë (fluoresserende kleurstowwe of fluoresserende probes) by die tradisionele PCR-reaksiestelsel, en bespeur die PCR-gloei- en verlengingsproses intyds volgens hul verskillende luminescerende meganismes.Fluorescerende seinveranderinge in die medium word gebruik om die hoeveelheid produkverandering in elke siklus van PCR te bereken.Tans is die mees algemene metodes fluoresserende kleurstofmetode en sondemetode.

Fluorescerende kleurstof metode:
Sommige fluoresserende kleurstowwe, soos SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ens., straal nie self lig uit nie, maar straal fluoressensie uit nadat dit aan die klein groef van dsDNA gebind is.Daarom, aan die begin van die PCR-reaksie, kan die masjien nie die fluoresserende sein opspoor nie.Wanneer die reaksie voortgaan na die uitgloei-verlenging (twee-stap metode) of verlenging stadium (drie-stap metode), word die dubbele stringe op hierdie tydstip oopgemaak, en die nuwe DNA polimerase Tydens string sintese word fluoresserende molekules in die dsDNA klein groef gekombineer en straal fluoressensie uit.Soos die aantal PCR-siklusse toeneem, kombineer meer en meer kleurstowwe met dsDNA, en die fluoresserende sein word ook voortdurend verbeter.Neem SYBR Green Ⅰ as 'n voorbeeld.
Sonde metode:
Taqman-sonde is die mees gebruikte hidrolise-sonde.Daar is 'n fluoresserende groep aan die 5′ einde van die sonde, gewoonlik FAM.Die sonde self is 'n volgorde aanvullend tot die teikengeen.Daar is 'n fluoresserende blusgroep aan die 3'-punt van die fluorofoor.Volgens die beginsel van fluoressensie-resonansie-energie-oordrag (Förster-resonansie-energie-oordrag, FRET), wanneer die verslaggewer fluoresserende groep (skenker fluoresserende molekule) en die blus fluoresserende groep (akseptor fluoresserende molekule) Wanneer die opwekking spektrum oorvleuel en die afstand is baie naby (7-10 fluorescerende fluorescerende molekule van die blik), die akseptormolekule, terwyl die outofluoressensie verswak word.Daarom, aan die begin van die PKR-reaksie, wanneer die sonde vry en ongeskonde in die sisteem is, sal die verslaggewer fluoresserende groep nie fluoressensie uitstraal nie.Tydens uitgloeiing bind die onderlaag en sonde aan die sjabloon.Tydens die verlengingstadium sintetiseer die polimerase voortdurend nuwe kettings.DNA-polimerase het 5′-3′ eksonuklease-aktiwiteit.Wanneer die sonde bereik word, sal die DNA-polimerase die sonde vanaf die sjabloon hidroliseer, die verslaggewer fluoresserende groep skei van die uitblus fluoresserende groep, en die fluoresserende sein vrystel.Aangesien daar 'n een-tot-een-verhouding tussen die sonde en die sjabloon is, is die sondemetode beter as die kleurstofmetode in terme van die akkuraatheid en sensitiwiteit van die toets.

Fig 1 Beginsel van qRT-PCR

Primer ontwerp
Beginsels:

Die primers moet ontwerp word in die gekonserveerde area van die nukleïensuurreeks en moet spesifisiteit hê.

Dit is die beste om cDNA-volgorde te gebruik, en mRNA-volgorde is ook aanvaarbaar.Indien nie, vind die cd's-streekontwerp van die DNA-volgorde uit.
Die lengte van die fluoresserende kwantitatiewe produk is 80-150bp, die langste is 300bp, die primerlengte is oor die algemeen tussen 17-25 basisse, en die verskil tussen die stroomop- en stroomaf-primers moet nie te groot wees nie.

Die G+C-inhoud is tussen 40% en 60%, en 45-55% is die beste.
Die TM-waarde is tussen 58-62 grade.
Probeer om primer dimers en self-dimers te vermy, (moenie meer as 4 pare van opeenvolgende komplementêre basisse verskyn nie) haarnaaldstruktuur, indien onvermydelik, maak ΔG<4.5kJ/mol* As jy nie kan verseker dat gDNA verwyder is tydens omgekeerde transkripsie Skoon nie, is dit die beste om die primers van die intron te ontwerp, en G′ kan nie gemodifiseerd wees nie, G′-gebied, T′ kan nie gemodifiseer word nie, /C, A/G kontinue struktuur (2-3) primers en nie-
spesifiek Die homologie van die heterogeen geamplifiseerde volgorde is verkieslik minder as 70% of het 8 komplementêre basishomologie.
Databasis:
KatoenFGD soek volgens sleutelwoorde
Primer ontwerp:
IDT-qPCR primer ontwerp

Fig2 IDT aanlyn primer ontwerp hulpmiddel bladsy

Fig3 resultaat bladsy vertoon
Ontwerp van lncRNA primers:
lncRNA:dieselfde stappe as mRNA.
miRNA:Die beginsel van die stam-lus-metode: Aangesien alle miRNA's kort reekse van ongeveer 23 nt is, kan direkte PKR-opsporing nie uitgevoer word nie, daarom word die stam-lusvolgorde-instrument gebruik.Die stam-lus-volgorde is 'n enkelstring-DNS van ongeveer 50 nt, wat op sigself 'n haarnaaldstruktuur kan vorm.3 'Die einde kan ontwerp word as 'n volgorde komplementêr tot die miRNA gedeeltelike fragment, dan kan die teiken miRNA aan die stam-lus volgorde verbind word tydens omgekeerde transkripsie, en die totale lengte kan 70bp bereik, wat in lyn is met die lengte van die geamplifiseerde produk bepaal deur qPCR.Tailing miRNA primer ontwerp.
Amplifikasie-spesifieke opsporing:
Aanlyn ontploffingsdatabasis: CottonFGD-ontploffing volgens volgorde-ooreenkoms
Plaaslike ontploffing: Verwys na die gebruik van Blast+ om plaaslike ontploffing te doen, linux en Macos kan direk 'n plaaslike databasis vestig, win10-stelsel kan ook gedoen word nadat ubuntu bash geïnstalleer is.Skep plaaslike ontploffingsdatabasis en plaaslike ontploffing;maak ubuntu bash oop op win10.
Let wel: Bolandkatoen en see-eilandkatoen is tetraploïede gewasse, so die resultaat van ontploffing sal dikwels twee of meer vuurhoutjies wees.In die verlede sal die gebruik van NAU-cd's as 'n databasis om ontploffing uit te voer waarskynlik twee homoloë gene met slegs 'n paar SNP-verskille vind.Gewoonlik kan die twee homoloë gene nie geskei word deur primerontwerp nie, dus word hulle as dieselfde behandel.As daar 'n duidelike indel is, word die primer gewoonlik op die indel ontwerp, maar dit kan lei tot die sekondêre struktuur van die primer Die vrye energie word hoër, wat lei tot 'n afname in amplifikasie doeltreffendheid, maar dit is onvermydelik.

Opsporing van primer sekondêre struktuur:
Stappe:maak oligo 7 oop → voer sjabloonvolgorde in → maak subvenster toe → stoor → vind primer op sjabloon, druk ctrl+D om primerlengte in te stel → analiseer verskeie sekondêre strukture, soos selfdimerisasieliggaam, heterodimeer, haarnaald, wanpassing, ens. Die laaste twee prente in Figuur 4 is die toetsresultate van die primers.Die resultaat van die voorste onderlaag is goed, daar is geen duidelike dimeer- en haarnaaldstruktuur nie, geen kontinue komplementêre basisse nie, en die absolute waarde van vrye energie is minder as 4,5, terwyl die agterste onderlaag kontinu toon Die 6 basisse is komplementêr, en die vrye energie is 8,8;daarbenewens verskyn 'n meer ernstige dimeer aan die 3'-punt, en 'n dimeer van 4 opeenvolgende basisse verskyn.Alhoewel die vrye energie nie hoog is nie, kan die 3' dimeer Chl amplifikasie spesifisiteit en amplifikasie doeltreffendheid ernstig beïnvloed.Daarbenewens is dit nodig om te kyk vir haarnaaldjies, heterodimere en wanpassings.

Fig3 oligo7 opsporing resultate
Opsporing van versterkingsdoeltreffendheid:
Die amplifikasie-doeltreffendheid van die PKR-reaksie beïnvloed die PKR-resultate ernstig.Ook in qRT-PCR is die amplifikasie-doeltreffendheid veral belangrik vir die kwantitatiewe resultate.Verwyder ander stowwe, masjiene en protokolle in die reaksiebuffer.Die kwaliteit van die primers het ook 'n groot invloed op die amplifikasie doeltreffendheid van qRT-PCR.Om die akkuraatheid van die resultate te verseker, moet beide die relatiewe fluoressensie-kwantifikasie en die absolute fluoressensie-kwantifikasie die amplifikasie-doeltreffendheid van die primers opspoor.Dit word erken dat die effektiewe qRT-PCR amplifikasie doeltreffendheid tussen 85% en 115% is.Daar is twee metodes:
1. Standaard kurwe metode:
a.Meng cDNA
b.Gradiëntverdunning
c.qPCR
d.Lineêre regressievergelyking om die versterkingsdoeltreffendheid te bereken
2. LinRegPCR
LinRegPCR is 'n program vir die ontleding van intydse RT-PCR Data, ook genoem kwantitatiewe PCR (qPCR) data gebaseer op SYBR Green of soortgelyke chemie.Die program gebruik nie-basislyn-gekorrigeerde data, voer 'n basislynkorreksie op elke monster afsonderlik uit, bepaal 'n venster-van-lineariteit en gebruik dan lineêre regressie-analise om 'n reguit lyn deur die PCR-datastel te pas.Vanaf die helling van hierdie lyn word die PCR-doeltreffendheid van elke individuele monster bereken.Die gemiddelde PCR-doeltreffendheid per amplikon en die Ct-waarde per monster word gebruik om 'n beginkonsentrasie per monster, uitgedruk in arbitrêre fluoressensie-eenhede, te bereken.Data-invoer en -uitvoer is deur 'n Excel-sigblad.Slegs monster
vermenging is nodig, geen gradiënt nie
stappe word vereis:(Neem Bole CFX96 as 'n voorbeeld, nie heeltemal masjien met duidelike ABI nie)
eksperiment:dit is 'n standaard qPCR eksperiment.
qPCR data uitset:LinRegPCR kan twee vorme van uitvoerlêers herken: RDML of kwantifiseringsversterkingsresultaat.Trouens, dit is die intydse opsporingswaarde van die siklusgetal en fluoressensiesein deur die masjien, en die versterking word verkry deur die fluoressensieveranderingswaarde van die lineêre segmentdoeltreffendheid te ontleed.
Dataseleksie: In teorie behoort die RDML-waarde bruikbaar te wees.Daar word beraam dat die probleem van my rekenaar is dat die sagteware nie RDML kan herken nie, so ek het die Excel-uitvoerwaarde as die oorspronklike data.Dit word aanbeveel om eers 'n rowwe sifting van die data uit te voer, soos die mislukking van die byvoeging van monsters, ens. Die punte kan in die uitvoerdata uitgevee word (natuurlik kan jy dit nie uitvee nie, LinRegPCR sal hierdie punte in die latere stadium ignoreer)

Fig5 qPCR data uitvoer

Fig6 seleksie van kandidaatmonsters

Data-invoer:Maak kwalifikasieversterkingsresultate oop.xls, → maak LinRegPCR oop → lêer → lees vanaf Excel → kies parameters soos getoon in Figuur 7 → OK → klik bepaal basislyne

Fig7 stappe van linRegPCR data invoer

Resultaat:As daar geen herhaling is nie, is geen groepering nodig nie.As daar herhaling is, kan die groepering in die monstergroepering geredigeer word, en die naam van die geen word in die identifiseerder ingevoer, en dan sal dieselfde geen outomaties gegroepeer word.Klik ten slotte op die lêer, voer Excel uit en bekyk die resultate.Die versterkingsdoeltreffendheid en R2 resultate van elke put sal vertoon word.Tweedens, as jy in groepe verdeel, sal die gekorrigeerde gemiddelde versterkingsdoeltreffendheid vertoon word.Maak seker dat die amplifikasie-doeltreffendheid van elke primer tussen 85% en 115% is.As dit te groot of te klein is, beteken dit dat die versterkingsdoeltreffendheid van die primer swak is.

Fig 8 Resultaat en data-uitvoer

Eksperimentele proses:
RNA kwaliteit vereistes:
Suiwerheid:1.72.0 dui aan dat daar oorblywende isotiosianaat kan wees.Skoon nukleïensuur A260/A230 moet ongeveer 2 wees. As daar 'n sterk absorpsie by 230 nm is, dui dit aan dat daar organiese verbindings soos fenaatione is.Daarbenewens kan dit opgespoor word deur 1,5% agarosegelelektroforese.Wys die merker, want die ssRNA het geen denaturasie nie en die molekulêre gewig logaritme het nie 'n lineêre verwantskap nie, en die molekulêre gewig kan nie korrek uitgedruk word nie.Konsentrasie: Teoretiesnieminder as 100ng/ul, as die konsentrasie te laag is, is die suiwerheid oor die algemeen laag nie hoog nie

Fig9 RNA-gel

Daarbenewens, as die monster kosbaar is en die RNA-konsentrasie hoog is, word dit aanbeveel om dit na ekstraksie in te neem, en die RNA te verdun tot 'n finale konsentrasie van 100-300ng/ul vir omgekeerde transkripsie.Indie proses van omgekeerde transkripsie, wanneer mRNA getranskribeer word, word oligo (dt) primers wat spesifiek aan polyA sterte kan bind vir omgekeerde transkripsie gebruik, terwyl lncRNA en circRNA ewekansige heksamer (Random 6 mer) primers gebruik vir omgekeerde transkripsie van totale RNA Vir miRNA word miRNA-spesifieke neklus omgekeerde transkripsie gebruik.Baie maatskappye het nou spesiale uitskotstelle bekend gestel.Vir die stam-lus metode, die tailing metode is meer gerieflik, hoë-deurset, en reagens-besparing, maar die effek van die onderskeid miRNAs van dieselfde familie behoort nie so goed soos die stam-lus metode te wees.Elke omgekeerde transkripsiestel het vereistes vir die konsentrasie van geenspesifieke primers (stam-lusse).Die interne verwysing wat vir miRNA gebruik word, is U6.In die proses van stam-lus inversie, moet 'n buis van U6 afsonderlik omgekeer word, en die voorste en agterste primers van U6 moet direk bygevoeg word.Beide circRNA en lncRNA kan HKG's as interne verwysing gebruik.IncDNA opsporing,
as daar geen probleem met RNA is nie, behoort cDNA ook goed te wees.As die perfeksie van die eksperiment egter nagestreef word, is dit die beste om 'n interne verwysingsgeen (Reference geen, RG) te gebruik wat gDNA van CD's kan onderskei.Oor die algemeen is RG 'n huishoudelike geen., HKG) soos getoon in Figuur 10;Op daardie tydstip het ek sojaboonopbergingsproteïen gemaak, en het actin7-bevattende introne as 'n interne verwysing gebruik.Die grootte van die geamplifiseerde fragment van hierdie primer in gDNA was 452bp, en as cDNA as 'n templaat gebruik is, was dit 142bp.Toe het die toetsresultate bevind dat 'n deel van die cDNA eintlik deur gDNA besmet is, en dit het ook bewys dat daar geen probleem was met die resultaat van omgekeerde transkripsie nie, en dit kan as 'n sjabloon vir PCR gebruik word.Dit is nutteloos om agarosegelelektroforese direk met cDNA uit te voer, en dit is 'n diffuse band, wat nie oortuigend is nie.

Fig 10 cDNA-opsporing

Die bepaling van qPCR toestandeis oor die algemeen geen probleem volgens die protokol van die kit, hoofsaaklik in die stap van tm waarde.As sommige primers nie goed ontwerp is tydens primer ontwerp nie, wat lei tot 'n groot verskil tussen die tm waarde en die teoretiese 60°C, word dit aanbeveel dat die cDNA Nadat die monsters gemeng is, 'n gradiënt PCR met primers laat loop, en probeer om te verhoed dat die temperatuur sonder bande as die TM waarde gestel word.

Data-analise

Die konvensionele relatiewe fluoressensie kwantitatiewe PCR verwerkingsmetode is basies volgens 2-ΔΔCT.Dataverwerkingsjabloon.

Verwante Produkte:

Real Time PCR Maklik^TM -Taqman

Real Time PCR Maklik^TM –SYBR GROEN I

RT Easy I (Master Premix vir eerste string cDNA sintese)

RT Easy II (Master Premix vir eerste string cDNA sintese vir qPCR)