Fluoresensie kwantitatiewe PCR (ook bekend as TaqMan PCR, hierna verwys as FQ-PCR) is 'n nuwe nukleïensuur kwantitatiewe tegnologie wat ontwikkel is deur PE (Perkin Elmer) in die Verenigde State van Amerika in 1995. Hierdie tegnologie is gebaseer op konvensionele PCR deur die byvoeging van fluoresserende gemerkte probes.In vergelyking met buigsame PCR, het FQ-PCR baie voordele om die kwantitatiewe funksie daarvan te verwesenlik.Hierdie artikel beoog om kortliks die kenmerke, beginsels, metodes en toepassings van die tegnologie te beskryf.
1 Kenmerke
FQ-PCR het nie net die hoë sensitiwiteit van gewone PCR nie, maar ook as gevolg van die toepassing van fluoresserende probes, kan dit die verandering van fluoresserende sein tydens PCR-versterking direk opspoor deur die foto-elektriese geleidingstelsel om kwantitatiewe resultate te verkry, wat baie tekortkominge van konvensionele PCR oorkom, so dit het ook die hoë spesifisiteit van DNA-hibridisering en die hoë spesifisiteit van DNA-tegnologie.
Algemene PCR-produkte moet byvoorbeeld waargeneem word deur agarosegelelektroforese en etidiumbromiedkleuring met ultraviolet lig of deur poliakrielamiedgelelektroforese en silwerkleuring.Dit verg nie net veelvuldige instrumente nie, maar verg ook tyd en moeite.Die vlekke wat gebruik word Ethidiumbromied is skadelik vir die menslike liggaam, en hierdie ingewikkelde eksperimentele prosedures bied geleenthede vir besoedeling en vals positiewe.FQ-PCR hoef egter net een keer die deksel oop te maak tydens die laai van monsters, en die daaropvolgende proses is heeltemal geslote buis-werking, wat nie PCR-na-verwerking vereis nie, wat baie nadele in konvensionele PCR-operasies vermy.Die eksperiment gebruik oor die algemeen die ABI7100 PCR termiese fietsryer wat deur PE-maatskappy ontwikkel is.
Die instrument het die volgende kenmerke: ① Wye toepassing: Dit kan gebruik word vir DNA en RNA PCR produk kwantifisering, geenuitdrukking navorsing, patogeen opsporing, en optimalisering van PCR toestande.② Unieke kwantitatiewe beginsel: Deur gebruik te maak van fluoresserend gemerkte probes, sal die hoeveelheid fluoressensie met die PCR-siklus ophoop na laseropwekking, om die doel van kwantifisering te bereik.③ Hoë werkdoeltreffendheid: Ingeboude 9600 PCR termiese siklus, rekenaarbeheerde 1 tot 2 uur om die versterking en kwantifisering van 96 monsters outomaties en sinchronies te voltooi.④ Geen behoefte aan gelelektroforese nie: Dit is nie nodig om die monster te verdun en te elektroforeseer nie, gebruik net 'n spesiale sonde om direk in die reaksiebuis op te spoor.⑤Geen besoedeling in die pyplyn nie: Die unieke volledig geslote reaksiebuis en foto-elektriese geleidingstelsel word aangeneem, dus hoef u nie bekommerd te wees oor besoedeling nie.⑥ Die resultate is reproduseerbaar: die kwantitatiewe dinamiese reeks is tot vyf ordes van grootte.Daarom, sedert hierdie tegnologie suksesvol ontwikkel is, is dit deur baie wetenskaplike navorsers gewaardeer en is dit op baie terreine toegepas.
2 Beginsels en metodes
Die werkbeginsel van FQ-PCR is om die 5′→3′ eksonuklease-aktiwiteit van Taq-ensiem te gebruik om 'n fluorescent-gemerkte sonde by die PCR-reaksiestelsel te voeg.Die sonde kan spesifiek hibridiseer met die DNA-sjabloon wat in die primervolgorde vervat is.Die 5'-punt van die sonde is gemerk met die fluoressensie-emissie-geen FAM (6-carboxyfluorescein, fluorescence emission peak at 518nm), en die 3'-end is gemerk met The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytetramethylpeakrhodence) wording van die sonde word gefosforileer om te verhoed dat die sonde verleng word tydens PCR-amplifikasie.Wanneer die sonde ongeskonde bly, onderdruk die uitblusgroep die fluoressensie-emissie van die emitterende groep.Sodra die emitterende groep van die blusgroep geskei is, word die inhibisie opgehef, en die optiese digtheid by 518nm neem toe en word deur die fluoressensie-opsporingstelsel opgespoor.In die renaturasiefase hibridiseer die sonde met die sjabloon-DNA, en die Taq-ensiem in die verlengingsfase beweeg langs die DNA-primer-sjabloon met die verlenging van die die sjabloon.Wanneer die sonde afgesny word, word die blus-effek vrygestel en die fluoresserende sein word vrygestel.Elke keer as die sjabloon gekopieer word, word 'n sonde afgesny, vergesel van die vrystelling van 'n fluoresserende sein.Aangesien daar 'n een-tot-een verband is tussen die aantal vrygestelde fluorofore en die aantal PKR-produkte, kan hierdie tegniek gebruik word om die sjabloon akkuraat te kwantifiseer.Die eksperimentele instrument gebruik oor die algemeen die ABI7100 PCR termiese fietsryer wat deur PE maatskappy ontwikkel is, en ander termiese fietsryers kan ook gebruik word.Indien die ABI7700 reaksietipe reaksiestelsel vir die eksperiment gebruik word, kan die kwantitatiewe resultate direk deur rekenaaranalise gegee word nadat die reaksie voltooi is.As jy ander termiese siklusse gebruik, moet jy 'n fluoressensiedetektor gebruik om die fluoressensiesein in die reaksiebuis terselfdertyd te meet om RQ+, RQ-, △RQ te bereken.RQ+ verteenwoordig die verhouding van die luminesensie-intensiteit van die fluoresserende emissiegroep van die monsterbuis tot die luminescentie-intensiteit van die blusgroep, RQ- verteenwoordig die verhouding van die twee in die blanko buis, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) verteenwoordig die hoeveelheid van die seinverandering tydens fluoressensieproses wat verkry kan word tydens fluoressensieproses, na PCR.As gevolg van die bekendstelling van fluoresserende probes, is die spesifisiteit van die eksperiment aansienlik verbeter.Die sondeontwerp moet oor die algemeen aan die volgende voorwaardes voldoen: ①Die lengte van die sonde moet ongeveer 20-40 basisse wees om die spesifisiteit van binding te verseker.②Die inhoud van GC-basisse is tussen 40% en 60% om duplisering van enkelnukleotiedvolgordes te vermy.③ Vermy hibridisasie of oorvleueling met primers.④ Die stabiliteit van die binding tussen die sonde en die sjabloon is groter as die stabiliteit van die binding tussen die primer en die sjabloon, dus moet die Tm-waarde van die sonde ten minste 5°C hoër as die Tm-waarde van die primer wees.Daarbenewens het die konsentrasie van die probe, die homologie tussen die probe en die sjabloonvolgorde, en die afstand tussen die probe en die primer almal 'n impak op die eksperimentele resultate.
Verwante Produkte:
China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman vervaardiger en verskaffer |Foregene (foreivd.com)
Postyd: 15 Okt-2021
