RT-qPCR eksperiment sluit RNA onttrekking en kwaliteit assessering, omgekeerde transkripsie en qPCR drie stappe, elke stap het 'n baie voorsorgmaatreëls, sal ons in detail hieronder bekendstel.

Ⅰ.RNA kwaliteit assessering

In RT-qPCR eksperiment, na die voltooiing van RNA ekstraksie, moet die kwaliteit van RNA geëvalueer word, en die opvolg eksperiment kan slegs uitgevoer word nadat dit gekwalifiseer is.Evalueringsmetodes sluit in spektrofotometer, Agilent gelelektroforese, Agilent 2100 analise, waaronder die mees gebruikte spektrofotometer en agarose gel elektroforese metode opsporing.Daar moet kennis geneem word dat hierdie twee metodes saam gebruik moet word om die opsporing en ontleding van RNA-konsentrasie, suiwerheid en integriteit te voltooi, om sodoende die kwaliteit van RNA te verseker.

Verwante RNA-isolasiestel: 

Seltotaal-RNA-isolasiestel

Hoogs gesuiwerde en hoë kwaliteit totale RNA kan verkry word vanaf verskeie gekweekte selle in 11min.

Diere Totale RNA Isolasie Kit

Vinnig en doeltreffend onttrek hoë suiwer en hoë kwaliteit totale RNA uit verskeie diereweefsels.

Spektrofotometer:

Die spektrofotometer word hoofsaaklik gebruik om die konsentrasie en suiwerheid van RNA te bepaal, maar dit kan nie die integriteit van RNA en genomiese residu opspoor nie.Onder hulle is A260/280 en A260/230 belangrike parameters vir die opsporing van RNA-suiwerheid, en RNA-suiwerheid kan opgespoor word volgens die fluktuasie van hul waardes:

1. 1.9< A260/280< 2.1, wat aandui dat RNA-suiwerheid goed is;A260/280<1.9, wat aandui dat daar proteïenresidu in RNA kan wees;A260/280>2.1, wat moontlike gedeeltelike afbraak van RNA aandui, wat verder bevestig kan word deur agarosegelelektroforese.

2. 2.0< A260/230< 2.2, wat aandui dat RNA-suiwerheid goed is;A260/230< 2.0, wat aandui dat daar residue van organiese reagense in RNA kan wees, soos fenole, etanol of suikers.

Agarose gel elektroforese:

Agarose-gelelektroforese-toets kan RNA-integriteit, genoom- en proteïenreste analiseer, maar kan nie die konsentrasie van RNA akkuraat kwantifiseer of die residue van organiese reagense opspoor nie.Neem byvoorbeeld eukariotiese RNA-sjablone:

1. Die RNA is aan agarosegelelektroforese onderwerp.As daar net drie enkelbande van 28sRNA, 18sRNA en 5.8sRNA op die jelkaart was, dui dit aan dat die onttrekte RNA ongeskonde is.As daar 'n sleepverskynsel is, dui dit op gedeeltelike afbraak van RNA.

2. As daar 'n enkele helder band tussen die gomgat en die 28sRNA-band is, kan daar genomiese DNA-residu wees.

3. As bande in die gomgat verskyn, dui dit daarop dat daar oorblyfsels van proteïen en ander makromolekulêre stowwe kan wees.

Ⅱ. Omgekeerde transkripsie

Nadat RNA-ekstraksie voltooi is, moet dit omgeskakel word in cDNA vir daaropvolgende eksperimente, so die omkeerstap is noodsaaklik.Omgekeerde transkripsie sal bekendgestel word uit die keuse van omgekeerde transkripsie en primer:

Omgekeerde transkripsie seleksie:

Die tipiese omgekeerde transkriptases sluit in AMV RTase en MMLV RTase.Die RNase H van AMV RTase het sterk aktiwiteit, kort sintese lengte, lae sintese hoeveelheid en goeie termiese stabiliteit (42 ~ 55 ℃).Die RNase H-aktiwiteit van MMLV RTase is swak, die sintese lengte is lank, die sintese hoeveelheid is hoog, en die termiese stabiliteit is swak (37 ~ 42 ℃).

Omdat RNase H ensiem die funksie het om RNA templaat af te breek, moet MMLV met swak RNase H aktiwiteit verkieslik geselekteer word tydens omgekeerde transkripsie, en na latere genetiese manipulasie het die termiese stabiliteit van MMLV 'n kwalitatiewe sprong bereik.Neem ForegeneForeasy omgekeerde transkripsie (M-MLV vir omgekeerde transkripsie) as 'n voorbeeld, dit is 'n nuwe omgekeerde transkripsie wat uitgedruk word in E. coli-gemanipuleerde bakterieë met behulp van genetiese rekombinasie-tegnologie.Dit is 'n rekombinante DNA-polimerase wat 'n komplementêre DNA-string sintetiseer vanaf enkelstring-RNA, DNA of 'n RNA:DNA-baster.Dit het geen RNase H-aktiwiteit nie, sterk stabiliteit, sterk RNA-affiniteit en hoë opsporingsensitiwiteit.

 

Foreasy omgekeerde transkripsie (M-MLV vir omgekeerde transkripsie)

Seleksie van onderlaag:

Oor die algemeen val RT-primers in drie kategorieë: oligo dT, ewekansige primers en geenspesifieke primers.Kies geskikte onderlaag vir gebruik volgens verskillende eksperimentele vereistes.

1. Indien die sjabloon van eukariotiese oorsprong is en die laat cDNA word gebruik vir roetine PCR amplifikasie, word Oligo (dT) aanbeveel;As die daaropvolgende eksperiment slegs vir qPCR gebruik word, word aanbeveel dat Oligo (dT) met ewekansige primers gemeng word om die doeltreffendheid van omgekeerde transkripsie te verbeter.

2. Indien die sjabloon van prokariote is, moet Random Primers of geenspesifieke primers gekies word vir omgekeerde transkripsie.

Ⅲ.qPCR

Fluoresensie-kwantifisering word hoofsaaklik uit die keuse van kwantitatiewe metodes, primerontwerpbeginsels, ROX-seleksie, reaksiestelselkonfigurasie en reaksietoestandinstelling, ens.

Seleksie van kwantitatiewe metodes:

Kwantitatiewe metodes word verdeel in relatiewe kwantitatiewe metodes en absolute kwantitatiewe metodes.Relatiewe kwantifisering kan gebruik word om die effek van sekere behandelingsmetodes op geenuitdrukking op te spoor, die verskil van geenuitdrukking op verskillende tye op te spoor en die verskil van geenuitdrukking in verskillende weefsels te vergelyk.Absolute kwantifisering kan die hoeveelheid nukleïensuur in die virus en so meer opspoor.Wanneer ons eksperimente doen, moet ons die toepaslike kwantitatiewe metodes volgens ons eie eksperimente kies.

Primer ontwerpbeginsels:

Die ontwerp van primer vir qPCR is direk verwant aan die amplifikasie doeltreffendheid en produk spesifisiteit.Daarom is die korrekte ontwerp van goeie primers die eerste stap van suksesvolle qPCR.By die ontwerp van onderlaag moet aandag gegee word aan die volgende beginsels wanneer aan die beginsel van konvensionele onderlaagontwerp voldoen word:

1. Die lengte van die teikenfragment word tussen 100 en 300 bp beheer;

2. Kruiseksonontwerp om die invloed van genomiese DNA te vermy;

3. Die ontwerpte primers moet getoets word vir amplifikasie doeltreffendheid, en slegs wanneer die amplifikasie doeltreffendheid die standaard (90-110%) bereik kan hulle vir kwantitatiewe eksperimente gebruik word;

4. Onderlaagkonsentrasie word gewoonlik tussen 0.1uM en 1.0uM geoptimaliseer.

Keuring vanROX:

In die proses van kwantitatiewe reaksie kan ROX die optiese padverskil, pipeteringsfout of volumeverskil wat veroorsaak word deur verdamping en kondensasie eenvormig aanpas, wat die herhaalbaarheid van die resultate verbeter.Daar moet egter kennis geneem word dat die keuse van ROX verband hou met die instrument.As die qPCR-instrument die funksie het om die verskil tussen gate outomaties reg te stel, hoef dit nie ROX by te voeg nie;anders moet dit ROX-regstelling byvoeg.Klein vennote in die aankoop van reagense moet volgens die instrument wat gebruik word om die korrekte ROX te kies, vermy latere foute.

Voorbereiding van reaksiestelsel:

Reaksievolumes van 20ul en 50ul word verkies.Die volgende sake moet aandag gegee word wanneer die stelsel geformuleer word:

1. Die reaksiestelsel moet voorberei word deur ventilasie in die ultraskoon werkbank, nuwe ddH₂O word vir elke eksperiment gebruik;

2. Elke eksperiment moet NTC voorberei om te verifieer of daar besoedeling in die stelsel is, en elke paar primers moet NTC doen wanneer die stelsel voorberei word;

3. Om vas te stel of daar gDNA-residu in die RNA-sjabloon is, kan NRT vir elke monster voorberei word vir opsporing;

4. Wanneer die stelsel voorberei word, word dit aanbeveel om ten minste 3 tegniese herhalings vir een monster te doen;

5. Wanneer die sjabloon cDNA is, word dit aanbeveel om 5-10 keer te verdun om die inhibisie-effek van omgekeerde transkripsiestelsel op qPCR-eksperiment te verminder.Dit is beter om die sjabloonhoeveelheid volgens gradiënt te verken, sodat die CT-waarde tussen 20-30 val;

6. Bepaal die vereiste aantal reaksies, verhoog met 5-10% op grond van die aantal reaksies, en bereken die volumekonfigurasiegetal;

7, die stelsel word voorberei met behulp van die premix-beginsel, meng na sentrifugering en verseker geen borrels nie;

8, So ver as moontlik om ondersteunende verbruiksgoedere te kies.

Verwante RT-qPCR Kit