Sterilisasie van pipetpunte en EP-buise, ens.

1. Berei 0.1% (een duisendste) DEPC (hoogs giftige stof) voor met gedeïoniseerde water, gebruik dit versigtig in 'n dampkap en stoor dit by 4°C weg van lig;

DEPC water is suiwer water behandel met DEPC en gesteriliseer deur hoë temperatuur en hoë druk.Getoets om vry van RNase, DNase en proteïnase te wees.

2. Plaas die pipetpunt en EP-buis in 0.1% DEPC, en verseker dat die pipetpunt en EP-buis gevul is met 0.1% DEP.

3. Beskerm teen lig, laat staan, oornag (12-24h)

4. Die boks wat die punt en EP-buis bevat, hoef nie in DEPC geweek te word nie.Nadat u die DEPC-water ongeveer in die punt of EP-buis verwyder het, pak dit op en draai dit toe.

5. 121 grade Celsius, 30min

6. 180 grade Celsius, droog vir 'n paar uur (ten minste 3 uur)

Let wel: a.Dra latexhandskoene en -maskers wanneer DEPC hanteer word!b, of sonder DEPC sterilisasie, 130 ℃, 90 min outoklaaf (baie laboratoriums hoë temperatuur sterilisasie twee keer)

RNA-ekstraksie-oorwegings

Twee hoofverskynsels van weefsel-RNA-isolasie mislukking

RNA-afbraak en oorblyfsels van onsuiwerhede in weefsels,met betrekking tot degradasie, kom ons kyk eers na hoekom RNA wat uit gekweekte selle onttrek word nie maklik afgebreek word nie.Bestaande RNA-ekstraksie-reagense bevat almal komponente wat RNase vinnig inhibeer.Voeg die lysaat by die gekweekte selle, en meng dit eenvoudig, al die selle kan deeglik met die lysaat gemeng word, en die selle is heeltemal gelys.Nadat die selle gelys is, inhibeer die aktiewe bestanddele in die lysaat onmiddellik die intrasellulêre RNase, sodat die RNA ongeskonde bly.Dit wil sê, omdat die gekweekte selle maklik en volledig met die lysaat in aanraking kom, word hul RNA nie maklik afgebreek nie;aan die ander kant word die RNA in die weefsel maklik afgebreek omdat die selle in die weefsel nie maklik met die lysaat vinnig kontak maak nie.as gevolg van voldoende kontak.Dus,as daar aanvaar word dat daar 'n manier is om die weefsel in 'n enkele sel te verander terwyl RNA-aktiwiteit inhibeer word, kan die probleem van agteruitgang heeltemal opgelos word.

Vloeibare stikstofmaal is die doeltreffendste so metode.Die maalmetode van vloeibare stikstof is egter baie lastig, veral wanneer die aantal monsters groot is.Dit het aanleiding gegee tot die volgende beste ding: die homogeniseerder.Diehomogeniseerdermetode oorweeg nie die vraag hoe RNase-aktiwiteit geïnhibeer word voordat selle met die lysaat in aanraking gebring word nie, maar bid eerder dat die tempo van weefselontwrigting vinniger is as die tempo waarteen intrasellulêre RNase RN afbreek.

Die effek van elektriese homogeniseerder is beter,en die effek van glashomogeniseerder is swak, maar oor die algemeen kan die homogenisatormetode nie die degradasieverskynsel voorkom nie.Daarom, as die ekstraksie afgebreek word, moet die oorspronklike elektriese homogeniseerder gebruik word vir maal met vloeibare stikstof;die oorspronklike glashomogeniseerder moet na 'n elektriese homogeniseerder verander word of direk met vloeibare stikstof gemaal word.Die probleem is amper 100% haalbaar.opgelos word.

Die onreinheidsresidu-probleem wat daaropvolgende eksperimente beïnvloed, het meer uiteenlopende oorsake as agteruitgang, en die oplossings verskil dienooreenkomstig.Ten slotte,indien daar agteruitgang of oorblywende onsuiwerhede in die weefsel is, moet die ekstraksiemetode/reagens vir die spesifieke eksperimentele materiaal geoptimaliseer word.Jy hoef nie jou kosbare monsters vir optimalisering te gebruik nie: jy kan 'n paar klein diere soos vis/hoender van die mark koop, die ooreenstemmende deel van die materiaal vir RNA-ekstraksie neem, en die ander deel vir proteïenekstraksie – maal met mond, maag en ingewande Uittreksel.

Die teiken-RNA van die onttrekte RNA word vir verskillende opvolgeksperimente gebruik, en die kwaliteitvereistes daarvan verskil

cDNA biblioteek konstruksie vereis RNA integriteit sonder residue van ensiem reaksie inhibeerders;Northern vereis hoër RNA integriteit en laer vereistes vir ensiem reaksie inhibeerders residue;RT-PCR vereis nie te hoë RNA-integriteit nie,maar inhibeer ensiemreaksies.Residuvereistes is streng.Die inset bepaal die uitset;elke keer as die doel is om die hoogste suiwerheid RNA te verkry, sal dit die mense en geld kos.

Versameling/berging van monsters

Faktore wat afbraak beïnvloed Nadat die monster die lewende liggaam/of die oorspronklike groei-omgewing verlaat het, sal die endogene ensieme in die monster RNA begin afbreek,en die afbraaktempo hou verband met die inhoud van endogene ensieme en temperatuur.Tradisioneel is daar net twee maniere om endogene ensiemaktiwiteit heeltemal te inhibeer: voeg lysaat dadelik by en homogeniseer deeglik en vinnig;sny in klein stukkies en vries dadelik in vloeibare stikstof.Beide benaderings vereis vinnige werking.Laasgenoemde is geskik vir alle monsters, terwyl eersgenoemde slegs geskik is vir weefsels met 'n lae inhoud van selle en endogene ensieme en makliker om te homogeniseer.Spesifiek, plantweefsel, lewer, timus, pankreas, milt, brein, vet, spierweefsel, ens. word die beste met vloeibare stikstof gevries voordat jy voortgaan.

Fragmentasie en homogenisering van monsters

Faktore wat agteruitgang en opbrengs beïnvloed Monsterfragmentasie isvir deeglike homogenisering, wat vir volledige en volledige vrystelling van RNA is.Selle kan direk gehomogeniseer word sonder om gebreek te word.Weefsels kan eers gehomogeniseer word nadat dit gebreek is.Gis en bakterieë moet met ooreenstemmende ensieme gebreek word voordat hulle gehomogeniseer kan word.Weefsels met 'n laer endogene ensiem-inhoud en makliker homogenisering kan op een slag in die lysaat deur 'n homogeniseerder fyngedruk en gehomogeniseer word;plantweefsel, lewer, timus, pankreas, milt, brein, vet, spierweefsel en ander monsters, Hulle is óf hoog in endogene ensieme óf word nie maklik gehomogeniseer nie,dus moet weefselontwrigting en homogenisering afsonderlik uitgevoer word.Die mees betroubare en mees produktiewe metode van fragmentasie is maal met vloeibare stikstof, en die mees betroubare metode van homogenisering is die gebruik van 'n elektriese homogeniseerder.'n Spesiale nota oor maal met vloeibare stikstof: die monster moet nie tydens die hele maalproses ontdooi word nie, aangesien endogene ensieme meer geneig is om te funksioneer wanneer dit gevries word.

Keuse van lysaat

Beïnvloeding van die gerief van operasie en die faktore van oorblywende endogene onsuiwerhede Die algemeen gebruikte lise oplossings kan amper die aktiwiteit van RNase inhibeer.Daarom is die sleutelpunt van die keuse van 'n lisis-oplossing om te oorweeg in kombinasie met die suiweringsmetode.Daar is een uitsondering:monsters met 'n hoë endogene ensieminhoud word aanbeveel om 'n lysaatbevattende fenol te gebruik om die vermoë om endogene ensieme te inaktiveer te verhoog.

Keuse van suiweringsmetode

Faktore wat oorblywende endogene onsuiwerhede beïnvloed, ekstraksiespoed Vir skoon monsters soos selle kan bevredigende resultate verkry word met feitlik enige suiweringsmetode byderhand.Maar vir baie ander monsters, veral dié met hoë vlakke van onsuiwerhede soos plante, lewer, bakterieë, ens., is die keuse van 'n geskikte suiweringsmetode van kardinale belang.Die kolom sentrifugale suiweringsmetode het 'n vinnige ekstraksiespoed en kan onsuiwerhede wat die daaropvolgende ensiematiese reaksie van RNA beïnvloed effektief verwyder, maar dit is duur (Foregene kan koste-effektiewe kits bied, meer besonderhede klikhier);die gebruik van ekonomiese en klassieke suiweringsmetodes, soos LiCl-presipitasie, kan ook bevredigende resultate verkry, maar die operasietyd is lank..

"Drie dissiplines en agt aandag" vir RNA-ekstraksie

Dissipline 1:Maak 'n einde aan die kontaminasie van eksogene ensieme.

Nota 1:Dra streng maskers en handskoene.

Nota 2:Die sentrifugeerbuise, puntkoppe, pipetstawe, elektroforesetenks en eksperimentele banke wat by die eksperiment betrokke is, moet deeglik weggedoen word.

Nota 3:Die reagense/oplossings wat by die eksperiment betrokke is, veral water, moet RNase-vry wees.

Dissipline 2:Blokkeer die aktiwiteit van endogene ensieme

Nota 4:Kies 'n geskikte homogeniseringsmetode.

Nota 5:Kies 'n geskikte lysaat.

Nota 6:Beheer die beginhoeveelheid van die monster.

Dissipline 3:Verduidelik jou onttrekkingsdoel

Nota 7:Met enige lysaatstelsel wat die maksimum beginhoeveelheid monster nader, daal die ekstraksie sukseskoers skerp.

Nota 8:Die enigste ekonomiese maatstaf vir suksesvolle RNA-ekstraksie is 'n sukses in daaropvolgende eksperimente, nie opbrengs nie.

Top 10 bronne van RNase-besmetting

1. Vingers is die eerste bron van eksogene ensieme, so handskoene moet gereeld gedra en vervang word.Daarbenewens moet maskers ook gedra word, want asemhaling is ook 'n belangrike bron van ensieme.'n Bykomende voordeel van die dra van 'n handskoenmasker is om die eksperimenteerder te beskerm.

2. Pipetpunte, sentrifugeerbuise, pipette – RNase kan nie deur sterilisasie alleen geïnaktiveer word nie, daarom moet pipetpunte en sentrifugeerbuise met DEPC behandel word, selfs al is hulle gemerk as DEPC behandel.Dit is die beste om 'n spesiale-doel pipet te gebruik, vee dit met 'n 75% alkohol katoen bal voor gebruik, veral die staaf;maak ook seker dat jy nie 'n kopverwyderaar gebruik nie.

3. Die water/buffer moet vry van RNase-kontaminasie wees.

4. Die toetstafel moet ten minste met 75% alkohol watteballetjies skoongevee word.

5.Endogene RNase Alle weefsels bevat endogene ensieme, so vinnige vriesing van weefsels met vloeibare stikstof is die beste manier om afbraak te verminder.Die vloeibare stikstofberging/maalmetode is inderdaad ongerieflik, maar dit is die enigste manier vir weefsels met hoë vlakke van endogene ensieme.

6. RNS-monsters RNS-ekstraksieprodukte kan spore van RNase-kontaminasie bevat.

7. Plasmiedekstraksie Plasmiedekstraksie gebruik dikwels RNAse om RNA af te breek, en die oorblywende RNAse moet verteer word met Proteinase K en deur PCI onttrek word.

8. RNS-berging Selfs as dit by lae temperatuur gestoor word, sal spoorhoeveelhede RNase RNA-afbraak veroorsaak.Die beste oplossing vir langtermyn-preservering van RNA is 'n sout/alkohol-suspensie, omdat alkohol alle ensiematiese aktiwiteit by lae temperature inhibeer.

9. Wanneer katione (Ca, Mg) hierdie ione bevat, sal verhitting by 80C vir 5 minute veroorsaak dat RNA gesplits word, dus as RNA verhit moet word, moet die preserveeroplossing 'n chelaatvormer (1mM natriumsitraat, pH 6.4) bevat.

10. Ensieme wat in daaropvolgende eksperimente gebruik word, kan deur RNase besmet wees.

10 wenke vir RNA-ekstraksie

1: Voorkom RNase-aktiwiteit vinnig.Monsters word vinnig gevries na versameling, en RNase word geïnaktiveer deur vinnige werking tydens lisis.

2: Kies 'n geskikte ekstraksiemetode vir weefsel met 'n hoë ribosieminhoud, en vetweefsel is die beste om die metode wat fenol bevat te gebruik.

3: Voorspellingskwaliteit vereis Noordelike, cDNA-biblioteekkonstruksie vereis hoë integriteit, en RT-PCR en RPA (Ribonukleasebeskermingstoets) vereis nie hoë integriteit nie.RT-PCR vereis hoë suiwerheid (ensiem inhibeerder residue).

4: Deeglike homogenisering is die sleutel tot die verbetering van opbrengs en die vermindering van agteruitgang.

5: Kontroleer die integriteit van RNA-elektroforese-opsporing, 28S: 18S = 2: 1 is 'n volledige teken, 1: 1 is ook aanvaarbaar vir die meeste eksperimente.

6: Verwydering van DNA vir RT-PCR, skikkingsanalise Dit is die beste om Dnase I te gebruik om DNA te verwyder.

7: Verminder die kontaminasie van eksogene ensieme – ensieme kan nie van buite af ingevoer word nie.

8: Wanneer lae-konsentrasie nukleïensuur gekonsentreer word, moet 'n ko-presipitasie reagens bygevoeg word.Maar om te verhoed dat die mede-presipitant ensieme en DNA-besmetting bevat.

9: Los die RNA deeglik op, indien nodig, verhit by 65C vir 5 minute.

geskikte bergingsmetode

Dit kan vir 'n kort tydjie by -20C gestoor word, en vir 'n lang tyd by -80C.Die eerste stap in die verbetering van RNA-opbrengste is om te besef dat die RNA-inhoud van verskillende monsters baie verskil.Hoë oorvloed (2-4 ug/mg) soos lewer, pankreas, hart, medium oorvloed (0.05-2 ug/mg) soos brein, embrio, nier, long, timus, eierstok, lae oorvloed (<0.05 ug/mg) mg) soos blaas, been, vet.

1: Lys selle om RN vry te stel – as RNA nie vrygestel word nie, sal die opbrengs verminder word.Elektriese homogenisering werk beter as ander homogeniseringsmetodes, maar moet dalk ook gekombineer word met ander metodes, soos vloeibare stikstofmashing, ensiematiese vertering (Lysozyme/Lyticase)

2: Optimalisering van die ekstraksiemetode.Die grootste probleme met fenol-gebaseerde metodes is onvolledige stratifikasie en gedeeltelike RNA-verlies (die supernatant kan nie heeltemal verwyder word nie).Onvolledige stratifikasie is as gevolg van hoë nukleïensuur- en proteïeninhoud, wat opgelos kan word deur die hoeveelheid lysaat wat gebruik word te verhoog of die hoeveelheid monster te verminder.'n Stap van chloroform-ekstraksie is by die vetweefsel gevoeg.RNA verlies kan verminder word deur terug te pomp of deur die organiese laag te verwyder gevolg deur sentrifugering.Die grootste probleem met kolomsentrifugering-gebaseerde metodes is oormaat monster.

Klassieke onttrekkingswenke

1. Fenol suiwering: Voeg 'n gelyke volume van 1:1 Fenol/Chloroform by en meng kragtig vir 1-2 minute.Sentrifugeer teen hoë spoed vir 2 minute.Verwyder die supernatant versigtig (80-90%).Moet nooit by die middelste laag uitkom nie.'n Gelyke volume van die reaksieoplossing kan by Fenol/Chloroform gevoeg word en die supernatant verwyder word.Die twee supernatante kan saam gemeng word vir nukleïensuurpresipitasie om die opbrengs te verbeter.Moenie te saggies wees wanneer jy meng nie, en moenie al die supernatant probeer verwyder nie.

2. Was met 70-80% etanol: Tydens was moet die nukleïensuur gesuspendeer word om te verseker dat die oorblywende sout weggespoel word.Terselfdertyd, onmiddellik nadat die etanol afgegooi is, sentrifugeer teen hoë spoed vir 'n paar sekondes, en verwyder dan die oorblywende etanol met 'n pipet.Los op nadat dit vir 5-10 minute by kamertemperatuur gestaan ​​het.

11. Onttrekking van spesiale organisasies

1. Veselagtige weefsel: Die sleutel tot RNA-ekstraksie uit veselagtige weefsel soos hart/skeletspier is om die weefsel heeltemal te ontwrig.Hierdie weefsels het 'n lae seldigtheid, so die hoeveelheid RNA per eenheid gewig van weefsel is laag, en dit is die beste om soveel as moontlik aanvangshoeveelheid te gebruik.Maak seker dat jy die weefsel deeglik maal onder vriestoestande.

2. Weefsels met 'n hoë proteïen/vet inhoud: brein/groente vet inhoud is hoog.Na PCI-ekstraksie bevat die supernatant wit flokkkies.Die supernatant moet weer met chloroform onttrek word.

3. Weefsels met hoë nukleïensuur/ribosiem inhoud: die milt/timus het hoë nukleïensuur en ribosiem inhoud.Maal weefsel onder vriestoestande gevolg deur vinnige homogenisering kan ribosime effektief inaktiveer.As die lysaat egter te viskeus is (weens hoë nukleïensuurinhoud), sal die PCI-ekstraksie nie effektief kan stratifiseer nie;die byvoeging van meer lysaat kan hierdie probleem oplos.Veelvuldige PCI-ekstraksies kan meer oorblywende DNA verwyder.As 'n wit neerslag vorm onmiddellik nadat alkohol bygevoeg is, dui dit op DNS-besmetting.Heronttrekking met suur PCI na ontbinding kan DNA-kontaminasie verwyder.

4. Plantweefsel: Plantweefsel is meer kompleks as diereweefsel.Oor die algemeen word plante onder vloeibare stikstoftoestande gemaal, dus is RNA-afbraak deur endogene ensieme ongewoon.As die afbraakprobleem nie opgelos word nie, word dit byna seker veroorsaak deur onsuiwerhede wat in die monster vervat is.Die onsuiwerhede wat in baie plante voorkom, sal lei tot residue, en die rede vir residue is dikwels omdat hierdie onsuiwerhede 'n paar ooreenkomste met RNA het: jy presipiteer en ek presipiteer, en jy adsorbeer en ek adsorbeer.Hierdie kenmerke bepaal dat hulle baie sterk ensieminhibeerders is.

Tans kan kommersiële RNA ekstraksie reagense aangepas word vir byna alle diereweefsels met klein aanpassings, maar daar is min kommersiële RNA ekstraksie reagense wat geskik kan wees vir die meeste plantweefsels.Gelukkig kan Foregene spesiale verskafplant RNA-ekstraksiestelle, ons hetPlant Total RNA Isolasie kit, Plant Total RNA Isolation kit Plus.Laasgenoemde is spesiaal ontwerp vir plante met hoë polisakkaried- en polifenoleinhoud.Vir RNA-ekstraksie is terugvoer van laboratoriumgebruikers besonder goed.

12. Die effek van monstervries en ontdooiing Die bevrore monster kan groter wees, en dit moet gesny word voordat dit vir RNA-ekstraksie gebruik word.Monsters is geneig om (moontlik gedeeltelik) te smelt tydens sny.Bevrore monsters moet dalk geweeg word voor RNA-ekstraksie, en ontdooiing sal beslis tydens hierdie proses plaasvind.Soms vind die ontdooiing van die monster ook plaas tydens die maalproses van vloeibare stikstof;of die bevrore monster word direk by die lysaat gevoeg sonder om vloeibare stikstof te maal, en ontdooiing sal beslis plaasvind voor die volledige homogenisering.Eksperimente het getoon dat bevrore weefsel meer geneig is tot RNA-afbraak tydens ontdooiing as vars weefsel.Die waarskynlike rede: Die vries-ontdooi proses ontwrig strukture binne die sel, wat dit makliker maak vir endogene ensieme om in direkte kontak met die RNA te kom.

13. Beoordeling van RNA kwaliteit Gewoonlik word elektroforese gebruik om die integriteit van RNA te beoordeel, en A260/A280 word gebruik om die suiwerheid van RNA te beoordeel.In teorie het ongeskonde RNA 'n verhouding van 28S:18S = 2.7:1, en die meeste data beklemtoon die verhouding van 28S:18S = 2:1.Die feit is dat byna geen van die RNA wat uit monsters onttrek word behalwe selle in 'n 2:1 verhouding is nie (dit is verkry met behulp van die Agilent Bioanalyzer).

Die elektroforeseresultate van RNA word deur baie faktore beïnvloed, insluitend sekondêre struktuur, elektroforese toestande, monsterlading, graad van versadiging deur EB, ens. Gebruik inheemse elektroforese om RNA op te spoor en gebruik DNA Merker as 'n kontrole.As die 28S by 2kb en die 18S by 0.9kb duidelik is, en 28S: 18S > 1, kan die integriteit voldoen aan die vereistes van die meeste daaropvolgende eksperimente.

A260/A280 is 'n aanwyser wat baie verwarring veroorsaak het.Eerstens is dit nodig om die oorspronklike betekenis van hierdie aanwyser vir nukleïensure te verduidelik: suiwer RNA, sy A260/280 = ongeveer 2.0.Suiwer RNA is die 'oorsaak' en A260/A280 = 2 is die 'effek'.Nou gebruik almal A260/A280 as 'n 'oorsaak', en dink dat "as A260/A280 = 2, dan is RNA suiwer", wat natuurlik tot verwarring lei.

As jy belangstel, kan jy 'n bietjie reagens wat dikwels in ekstraksie gebruik word, soos fenol, guanidien isothiocyanate, PEG, ens., by jou RNA-monster voeg, en dan die A260/A280-verhouding meet.Die realiteit is dat baie van die reagense wat vir RNA-ekstraksie gebruik word, sowel as baie onsuiwerhede in die monster, rondom A260 en A280 absorbeer, wat A260/A280 beïnvloed.

Die mees leersame benadering tans is om RNA-monsters in die 200-300 nm-reeks te skandeer.Die kurwe van suiwer RNA het die volgende kenmerke: die kurwe is glad, A230 en A260 is twee buigpunte, A300 is naby 0, A260/A280 = ongeveer 2.0, en A260/A230 = ongeveer 2.0.Indien skanderingsdata nie beskikbaar is nie, moet die A260/A230 verhouding ook bepaal word, aangesien hierdie verhouding meer sensitief is vir oordrag van alle onsuiwerhede wat die ensiematiese reaksie beïnvloed.Neem die lineêre omvang van die toestel in ag (0.1–0.5 vir A260).

Daar is twee ander nuttige verskynsels: die verhouding sal ongeveer 0,3 laer wees wanneer A260/A280 in water gemeet word;terwyl die verhouding gemeet in 10 mM EDTA ongeveer 0,2 hoër is as dié gemeet in 1 mM EDTA.

Verwante Produkte:

China Plant Total RNA Isolation Kit vervaardiger en verskaffer |Foregene (foreivd.com)

RNA isolasie reeks verskaffers en fabriek |China RNA isolasie reeks vervaardigers (foreivd.com)

RNA-isolasiereeks – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)