Dit is welbekend dat in die sentrale dogma, RNA die transkripsiebemiddelaar tussen DNA en proteïenuitdrukking is.In vergelyking met die opsporing van DNA, kan die opsporing van RNA meer objektief die geenuitdrukking in organismes weerspieël.Eksperimente wat RNA behels, sluit in: qRT-PCR, RNA-Seq en samesmeltingsgeen-opsporing, ens. Op grond van die eienskappe van RNA self (die suikerring van RNA het een meer vrye hidroksielgroep as die suikerring van DNA), tesame met 'n groot aantal RNases in die omgewing, is RNA meer onstabiel en makliker om afgebreek te word as DNA.Vullis in, vullis uit, as die kwaliteit van RNA nie goed is nie, dan moet die eksperimentele resultate onbevredigend wees, spesifiek gemanifesteer as onakkurate data of swak herhaalbaarheid.Daarom moet meer aandag aan die verwerking van RNA gegee word, en die skakel van kwaliteitbeheer is ook belangriker om die akkuraatheid en akkuraatheid van daaropvolgende eksperimentele data te verseker.

Vir die kwaliteitsbeheer van RNA is daar oor die algemeen die volgende algemeen gebruikte metodes:

• Spektrofotometrie
• agarose gel elektroforese
• Agilent Bioanalyzer
• intydse fluoresserende kwantitatiewe PCR
• Qubit fluoresserende kleurstof metode

01 Spektrofotometrie

RNA het gekonjugeerde dubbelbindings en het 'n absorpsiepiek by 'n golflengte van 260nm.Volgens Lambert-Beer se wet kan ons die RNA-konsentrasie uit die absorpsiepiek by 260nm bereken.Daarbenewens kan ons ook die suiwerheid van RNA bereken volgens die verhouding van 260nm, 280nm en 230nm absorpsiepieke.280nm en 230nm is die absorpsiepieke van onderskeidelik proteïene en klein molekules.Die verhouding van A260/A280 en A260/A230 van gekwalifiseerde RNA-suiwerheid moet groter as 2 wees. As dit minder as 2 is, beteken dit dat daar proteïen- of kleinmolekule-kontaminasie in die RNA-monster is en weer gesuiwer moet word.Besoedelingsbronne sal stroomaf-eksperimente beïnvloed, soos om die amplifikasie-doeltreffendheid van PCR-reaksies te inhibeer, wat lei tot onakkurate kwantitatiewe resultate.Die suiwerheid van RNA het 'n groot invloed op daaropvolgende resultate, dus is spektrofotometrie oor die algemeen 'n onontbeerlike gehaltebeheerskakel in die eerste stap in nukleïensuur-eksperimente.

Figuur 1. Tipiese RNA/DNA Absorpsie Spektrum

02 Agarosegelelektroforese

Benewens suiwerheid, is die integriteit van RNA ook een van die belangrike aanwysers vir die beoordeling van die kwaliteit van RNA.Die afbraak van RNA sal lei tot 'n groot aantal kort fragmente in die monster, dus sal die aantal RNA-fragmente wat effektief opgespoor en deur die verwysingsvolgorde gedek kan word verminder word.RNA-integriteit kan gekontroleer word deur elektroforese van totale RNA op 'n 1% agarosegel.Hierdie metode kan die jel self opstel, of die voorafvervaardigde E-Gel™-stelsel vir integriteitstoetsing gebruik.Meer as 80% van die totale RNA is ribosomale RNA, waarvan die meerderheid uit 28S en 18S rRNA (in soogdierstelsels) bestaan.Goeie kwaliteit RNA sal twee duidelike helder stawe, wat onderskeidelik 28S en 18S helder stawe is, by 5 Kb en 2 Kb toon, en die verhouding sal geneig wees om naby 2:1 te wees.As dit in 'n diffuse toestand is, beteken dit dat die RNA-monster moontlik afgebreek is, en dit word aanbeveel om die metode wat later beskryf word te gebruik om die kwaliteit van RNA verder te toets.

Figuur 2. Vergelyking van afgebreekte (baan 2) en ongeskonde RNA (baan 3) op agarosegelelektroforese

03 Agilent Bioanalyzer

Benewens die agarosegel-elektroforesemetode wat hierbo beskryf word, wat ons kan help om die integriteit van RNA eenvoudig en vinnig te identifiseer, kan ons ook die Agilent-bioanaliseerder gebruik om die integriteit van RNA te bepaal.Dit gebruik 'n kombinasie van mikrofluidika, kapillêre elektroforese en fluoressensie om RNA-konsentrasie en integriteit te bepaal.Deur die ingeboude algoritme te gebruik om die profiel van die RNA-monster te ontleed, kan die Agilent-bioanaliseerder 'n verwysings-RNA-integriteitswaarde, RNA-integriteitsnommer (hierna verwys as RIN) bereken [1].Hoe groter die waarde van RIN, hoe hoër is die integriteit van die RNA (1 is uiters gedegradeer, 10 is die volledigste).Sommige eksperimente wat RNA behels, stel voor dat RIN as 'n parameter vir kwaliteitbeoordeling gebruik word.Deur hoë-deurset-volgordebepalingseksperimente (hierna na verwys as NGS) as 'n voorbeeld te neem, dui die riglyne van Oncomine™ Human Immune Repertoire, wat gebruik word om B-sel- en T-sel-antigeenreseptore in Thermo Fisher se Oncomine-paneelreeks op te spoor, daarop dat monsters met RIN-waardes groter as 4, meer effektief gelees en gekloon kan word 3.Daar is verskillende aanbevole reekse vir verskillende panele, en dikwels kan 'n hoër RIN meer effektiewe data bring.

Figuur 3, in Oncomine™ Human Immune Repertoire-eksperimente, kan monsters met RIN groter as 4 meer effektiewe leeswerk en T-selklone opspoor.【2】

Die RIN-waarde het egter ook 'n paar beperkings.Alhoewel RIN 'n hoë korrelasie met die kwaliteit van NGS eksperimentele data het, is dit nie geskik vir FFPE monsters nie.FFPE-monsters is vir 'n lang tyd chemies behandel, en die onttrekte RNA het oor die algemeen 'n relatief lae RIN-waarde.Dit beteken egter nie dat die effektiewe data van die eksperiment onbevredigend moet wees nie.Om die kwaliteit van FFPE-monsters akkuraat te assesseer, moet ons ander metings as RIN gebruik.Benewens RIN, kan Agilent bioanalyzer ook DV200-waarde as 'n evalueringsparameter van RNA-kwaliteit bereken.DV200 is 'n parameter wat die verhouding van fragmente groter as 200 bp in 'n RNA-monster bereken.DV200 is 'n beter aanduiding van FFPE monster kwaliteit as RIN.Vir die RNA wat deur FFPE onttrek word, het dit 'n baie hoë korrelasie met die aantal gene wat effektief opgespoor kan word en die diversiteit van gene [3].Alhoewel DV200 die tekortkominge in die kwaliteitopsporing van FFPE kan vergoed, kan die Agilent bio-ontleder steeds nie die kwaliteitprobleme in RNA-monsters volledig ontleed nie, insluitend of daar inhibeerders in die monsters is.Inhibeerders self kan die versterkingsdoeltreffendheid van stroomaf-eksperimente beïnvloed en die hoeveelheid nuttige data verminder.Om te weet of daar 'n inhibeerder in die monster is, kan ons die intydse fluoresserende kwantitatiewe PCR-metode gebruik wat hierna beskryf word.

04 intydse fluoresserende kwantitatiewe PCR

Die intydse fluoresserende kwantitatiewe PCR-metode kan nie net die inhibeerders in die monster opspoor nie, maar ook die kwaliteit van RNA in die FFPE-monster akkuraat weerspieël.In vergelyking met Agilent biologiese ontleders, is intydse fluoressensie kwantitatiewe instrumente meer gewild in groot biologiese laboratoriums as gevolg van hul wyer toepassing.Om die kwaliteit van RNA-monsters te toets, hoef ons slegs primer-probes vir interne verwysingsgene, soos GUSB (Katnr. Hs00939627) te koop of voor te berei.Deur hierdie stel primers, probes en standaarde (totale RNA van bekende konsentrasie) te gebruik om absolute kwantitatiewe eksperimente uit te voer, kan die effektiewe RNA-fragmentkonsentrasie bereken word as die evaluasiestandaard van RNA kwaliteit (Functional RNA Quantitation (FRQ) kortweg).In 'n NGS-toets het ons gevind dat die FRQ van RNA-monsters 'n baie hoë korrelasie met die effektiewe datavolume het.Vir alle monsters groter as 0.2ng/uL FRQ, kan ten minste 70% van die lesings effektief die verwysingsvolgorde dek (Figuur 4).

Figuur 4, die FRQ waarde opgespoor deur die fluoressensie kwantitatiewe metode het 'n baie hoë korrelasie (R2>0.9) met die effektiewe data verkry in die NGS eksperiment.Die rooi lyn is die FRQ-waarde gelyk aan 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

Benewens die feit dat dit van toepassing is op FFPE-monsters, kan die intydse kwantitatiewe PCR-metode ook inhibeerders in monsters effektief monitor.Ons kan die monster wat opgespoor moet word by die reaksiestelsel met Interne Positiewe Kontrole (IPC) en sy Assay voeg, en dan fluoressensie-kwantifisering uitvoer om die Ct-waarde te verkry.As die Ct-waarde agter die Ct-waarde in die geen-monster-reaksie bly, dui dit aan dat die inhibeerder in die monster teenwoordig is en inhibeer die amplifikasie-doeltreffendheid in die reaksie.

05 Qubit fluoresserende kleurstofmetode

Qubit Fluorometer is die mees gebruikte klein toestel vir nukleïensuurkonsentrasie en suiwerheidsopsporing, wat maklik is om te bedryf en in byna elke molekulêre biologie-laboratorium bestaan.Dit bereken die konsentrasie van nukleïensuur akkuraat deur die opsporing en nukleïensuurbindende fluoresserende kleurstof (Qubit-opsporingsreagens).Qubit het hoë sensitiwiteit en spesifisiteit, en kan RNA akkuraat tot pg/µL konsentrasie kwantifiseer.Benewens die bekende vermoë om die nukleïensuurkonsentrasie akkuraat te kwantifiseer, kan Thermo Fisher se jongste nuwe model, Qubit 4.0, ook die integriteit van RNA opspoor.Qubit 4.0 se RNA-opsporingstelsel (RNA IQ Assay) bespeur die integriteit van RNA deur gelyktydig twee spesifieke fluoresserende kleurstowwe op te spoor.Hierdie twee fluoresserende kleurstowwe kan onderskeidelik aan groot fragmente en klein fragmente van RNA bind.Hierdie twee fluoresserende kleurstowwe dui die proporsie van groot fragmente van RNA in die monster aan, en hieruit kan die IK (Integriteit en Kwaliteit) waarde wat die RNA kwaliteit verteenwoordig, bereken word.Die IK-waarde is van toepassing op beide FFPE en nie-FFPE monsters, en het 'n groot invloed op die daaropvolgende volgorde kwaliteit.Met NGS-eksperimente as 'n voorbeeld, in die RNA-Seq-toetseksperimente wat op die Ion torrent™-platform uitgevoer is, het die meeste monsters met IK-waardes groter as 4 ten minste 50% effektiewe leeswerk gehad (Figuur 5).In vergelyking met die bogenoemde opsporingsmetodes, is Qubit IQ Assay nie net geriefliker om te bedryf nie en neem dit minder tyd (binne vyf minute), maar het dit ook 'n goeie korrelasie tussen die gemete parameter IK-waarde en die datakwaliteit van stroomaf-eksperimente.

Figuur 5, daar is 'n groot korrelasie tussen die Qubit RNA IK-waarde en die gekarteerde lees van RNA-Seq.【5】

Deur bogenoemde inleiding glo ek dat almal 'n voldoende begrip het van verskillende RNA-gehaltebeheermetodes.In die praktyk kan jy kiesdie ooreenstemmende metode volgens die monstertipe en bestaande instrumente.Slegs deur die kwaliteit van RNA goed te beheer, kan ons die mislukking van daaropvolgende eksperimente vermy wat veroorsaak word deur swak monsterkwaliteit, en sodoende kosbare tyd, energie en koste bespaar.

Verwysingsprodukte:

Diere Totale RNA Isolasie Kit

Seltotaal-RNA-isolasiestel

verwysings

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.Die RIN: 'n RNA-integriteitsnommer vir die toekenning van integriteitswaardes aan RNA-metings.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 Oncomine Human Immune Repertoire Gebruikersgids (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】 Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Verbeterde gehalte-metrieke vir die assessering van RNA afgelei van argiefformalien-vaste paraffien-ingeslote weefselmonsters, toksikologiese wetenskappe, volume 3 – 700 Augustus, 1720, uitgawe 3, 3, 70, 3https://doi.org/10.1093/toxsci/