Ons is ervare vervaardiger.Wen die meerderheid in die deurslaggewende sertifiserings van sy mark vir groot afslag in China High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Kwaliteit is die fabriek se lewe, Fokus op die vraag van die klant is die bron van maatskappy se oorlewing en ontwikkeling, Ons hou by eerlikheid en goeie trou werkshouding, sien uit na jou koms!
Ons is ervare vervaardiger.Wen die meerderheid in die deurslaggewende sertifisering van sy mark virChina Taq DNA Polimerase, Qpcr, Ons maatskappy beloof: billike pryse, kort produksietyd en bevredigende na-verkope diens, ons verwelkom u ook om ons fabriek te besoek wanneer u wil.Wens nou het ons 'n aangename en langtermyn besigheid saam!!!

Beskrywings

Hierdie stel gebruik 'n unieke lysisbufferstelsel wat RNA vinnig uit gekweekte selmonsters kan vrystel vir RT-qPCR-reaksies, en sodoende die tydrowende en moeisame RNA-suiweringsproses uitskakel.Die RNA-sjabloon kan binne net 7 minute verkry word.Die 5×Direct RT Mix en 2×Direct qPCR Mix-SYBR reagense wat deur die kit verskaf word, kan vinnig en effektief intydse kwantitatiewe PCR-resultate verkry.

5×Direct RT Mix en 2×Direct qPCR Mix-SYBR het sterk inhibeerder toleransie, en die lysaat van die monsters kan direk as die sjabloon vir RT-qPCR gebruik word.Hierdie stel bevat die unieke RNA hoë-affiniteit Foregene omgekeerde transkriptase, en Hot D-Taq DNA polimerase, dNTPs, MgCl₂, reaksiebuffer, PCR-optimaliseerder en stabiliseerder.

Spesifikasies

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Kit komponente

Kenmerke en voordele

■ Eenvoudig en doeltreffend: met Cell Direct RT-tegnologie kan RNA-monsters in net 7 minute verkry word.

■ Die monsteraanvraag is klein, so laag as 10 selle kan getoets word.

■ Hoë deurset: dit kan RNA vinnig opspoor in selle wat in 384, 96, 24, 12, 6-put plate gekweek is.

■ DNA Eraser kan vrygestelde genome vinnig verwyder, wat die impak op daaropvolgende eksperimentele resultate aansienlik verminder.

■ Geoptimaliseerde RT- en qPCR-stelsel maak die twee-stap RT-PCR omgekeerde transkripsie meer doeltreffend en PCR meer spesifiek, en meer bestand teen RT-qPCR reaksie inhibeerders.

Kit aansoek

Omvang van toepassing: gekweekte selle.

- RNA vrygestel deur monsterlisis: slegs van toepassing op die RT-qPCR-sjabloon van hierdie kit.

- Die stel kan vir die volgende doeleindes gebruik word: geenuitdrukking-analise, verifikasie van siRNA-gemedieerde geenstilte-effek, dwelmsifting, ens.

Diagram

Berging en raklewe

Deel I van hierdie stel moet by 4℃ gestoor word;Deel II moet by -20℃ gestoor word.

Foregene Protease Plus II moet by 4 ℃ gestoor word, moenie by -20 ℃ vries nie.

Reagens 2×Direct qPCR Mix-SYBR moet by -20℃ in die donker gestoor word;as dit gereeld gebruik word, kan dit ook by 4 ℃ gestoor word vir korttermynberging (gebruik binne 10 dae). Ons is ervare vervaardiger.Wen die meerderheid in die deurslaggewende sertifiserings van sy mark vir Groot afslag China Hoë Sensitiwiteit Eenstap Probe Rt-Qpcr Kit V2, Kwaliteit is die fabriek se lewe, Fokus op die klant se vraag is die bron van maatskappy oorlewing en ontwikkeling, Ons hou by eerlikheid en goeie trou werk houding, sien uit na jou koms!
Groot afslagChina Taq DNA Polimerase, Qpcr, Ons maatskappy beloof: billike pryse, kort produksietyd en bevredigende na-verkope diens, ons verwelkom jou ook om ons fabriek te besoek wanneer jy wil.Wens nou het ons 'n aangename en langtermyn besigheid saam!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Kat.nr.DRT-01021/01022

Vir sel direkte RT-qPCR met behulp van ≤ 1000,000 selle

Produk bekendstelling

Hierdie produk gebruik 'n unieke lysisbufferstelsel om RNA vinnig uit gekweekte selmonsters vry te stel vir RT-qPCR-reaksies, wat die tydrowende en moeisame RNA-suiweringsproses uitskakel, en slegs 7 minute om die vereiste RNA-sjabloon te verkry, met die 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman wat deur die kit verskaf word, kan vinnig en doeltreffend intydse PCR-resultate verkry.

5× Direct RT Mix en 2× Direct qPCR Mix-Taqman het sterk inhibeerdertoleransie en kan doeltreffende omkering en spesifieke versterking uitvoer deur die lysaat van die monster te gebruik wat as sjabloon gemeet moet word.Die reagens bevat Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polimerase, dNTPs, MgCl₂, Reaksiebuffer, PCR Optimizer en Stabiliseerder, wat saam met lysisbuffer gebruik kan word om monsters vinnig en maklik op te spoor, en het die kenmerke van hoë sensitiwiteit, spesifisiteit en stabiliteit.

Produk Funksies

Eenvoudige, effektiewe Cell Direct RT-tegnologie wat so min as 7 minute neem om RNA-monsters te kry.

Monstervereistes is klein, en 'n minimum van 10 gekweekte selle kan vir eksperimentering gebruik word.

Hoë deurset vir vinnige RNA-verkryging van gekweekte selle soos 384-, 96-, 24-, 12- en 6-put plate.

DNA Eraser is in staat om vrygestelde genome vinnig te verwyder, wat die impak op daaropvolgende eksperimentele resultate aansienlik verminder.

Geoptimaliseerde RT- en qPCR-stelsels maak twee-stap RT-PCR moontlik met meer doeltreffende omgekeerde transkripsie, spesifisiteit en sterker RT-qPCR reaksie-inhibeerder toleransie.

Kit aansoek

Omvang van toepassing: Gekweekte selle.

Monster lisis geïnterpreteer RNA: slegs gebruik as 'n twee-stap RT-qPCR templaat.

Kits kan vir die volgende doeleindes gebruik word: geen-regulerende uitdrukking-analise, alleeltoetsing, dwelmsifting, ens.

Kit beperkings

Geamplifiseerde fragmente ≤ 300 bp.

Kits word gebruik om selle vars te kweek.

Produk kwaliteit beheer

Volgens die FOREGENE se Total Quality Management System, word elke bondel Cell Direct RT-qPCR reeks kits verskeie kere streng getoets om die betroubaarheid en stabiliteit van die kwaliteit van elke bondel kits te verseker.

Kit inhoud

*:Sel Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman kan afsonderlik gekoop word, besonderhede word verskaf in Bylaag 1 (BLADSY 13).

Bergingstoestande

1. Versendingsvoorwaardes

Die hele proses van lae-temperatuur yspakkas vervoer, om te verseker dat die stel in die toestand <4 °C is.

2. Bergingstoestande

Berg deel I by 4°C en Deel II by -20°C.

Die Foregene Protease Plus II moet by 4°C gestoor word, nie by -20°C gevries nie.

Reagens 2× Direct qPCR Mix-Taqman word by -20°C gestoor, of by 4°C vir korttermyngebruik indien gereeld gebruik (binne 10 dae).

Kit komponent inligting

Buffer CL: Verskaf die omgewing wat benodig word vir sellise-reaksies.

Buffer ST: Beëindig die aktiewe stof in die lysaat om effekte op daaropvolgende RT te vermy.

DNA Eraser: DNA-verwyderaar, die effek van die verwydering van die genoom op daaropvolgende eksperimente.

5× Direct RT Mix: Bevat hoë RNA-affiniteit Foregene Reverse Transcriptase, RNase-inhibeerder, dNTP's, stabiliseerders, versterkers, optimeerders en omgekeerde transkripsie-inleiders vir optimale belyning (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: In die konteks van lisisbuffer word selle gelys om nukleïensure vry te stel.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Hierdie reagens bevat Hot D-Taq DNA Polimerase, dNTPs, MgCl₂, reaksiebuffer, PCR-optimaliseerder en stabiliseerder.

20× ROX Reference Dye: Word gewoonlik gebruik op Real Time PCR-versterkingsinstrumente van ABI, Stratagene en ander maatskappye, dit word gebruik om die verskil tussen PCR-buise en -buise aan te pas wat veroorsaak word deur PCR-doseringsfoute.Die 20× ROX Reference Dye-konsentrasie wat vir verskillende instrumente benodig word, verskil, en die gebruiker kan dit byvoeg volgens die aanbevole konsentrasie van die instrument.

RNase-vry ddH₂O: RNase-vry gesteriliseerde ultra suiwer water vir twee-stap RT-qPCR reaksies.

Voorsorgmaatreëls:(Maak seker dat u die voorsorgmaatreëls noukeurig lees voordat u die kit gebruik)

Gee aandag aan die werkingsmetode van die eksperiment om kruiskontaminasie tussen monsters te vermy.

Gee aandag aan die netheid van die eksperimentele omgewing en gereedskap om RNase-kontaminasie en RNA-afbraak te vermy.

Neem vars of goed bewaarde selmonsters en gebruik nooit herhaalde vries-ontdooide selmonsters nie.

5× Direct qPCR Mix,2× Direct qPCR Mix-Taqman moet herhaalde vries-ontdooi vermy, anders sal dit omgekeerde transkripsie en PCR doeltreffendheid beïnvloed.

Voorbereidingrantsoenevooroperasie

Maak seker dat u die instruksies noukeurig lees voordat u hierdie kit gebruik.Die Cell Direct RT-qPCR Kit is eenvoudig, gerieflik en vinnig om te gebruik, en die instruksies verskaf volledige inligting oor die hele stel en hoe om dit korrek te gebruik.Berei asseblief die nodige eksperimentele materiaal en toerusting voor voor gebruik.

Eksperimentele materiaal en toerusting

◆ Kultuurselle.

◆ 1,5 ml of 2 ml, RNase-/DNase-vrye sentrifugebuis, RNase-/DNase-vrye punt, 0,2 ml steriele qPCR-buis.

◆ qPCR masjien, pipet, tafelblad sentrifuge (≥13 400×g) (na gelang van eksperimentele behoeftes), ens.

Veiligheid

◆ Hierdie produk is slegs vir wetenskaplike navorsingsdoeleindes, moet dit asseblief nie vir farmaseutiese, kliniese, voedsel- en kosmetiese doeleindes gebruik nie.

◆ Wanneer chemikalieë gebruik word, dra toepaslike laboratoriumklere, handskoene, beskermende bril, ens.

Operasiegidse

Sel Lysis stelsels, RT stelsels, en qPCR reaksie oplossing aanvulling pakke kan afsonderlik gekoop word, vir besonderhede in Bylaag 1 (BLADSY 13).

Bedryfsgids

A: Monster RNA vrystelling

1. Selle is voorbehandel: Was die selkultuurplaat met koue PBS, lyseer dan die selle (10-10⁶), 10⁶ as die hoeveelheid selle, word aanbeveel Voorgene die sel 'n RNA-isolasiestel die Total (DE-03111) of Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) vir RNA-ekstraksie en suiwering.

1.1.Adherente selle (24-put plaat as 'n voorbeeld)

1.1.1.Bepaal die aantal selle in elke put, bepaal dat die aantal selle 1 × 10 is⁵, en gebruik 'n pipet om die kultuurmedium uit die kultuurbak te verwyder.

1.1.2.Voeg 200 μl voorafverkoelde 1 × PBS by elke put.Moenie herhaaldelik pipet en PBS uit die putte verwyder nie.Kantel die plaat en verwyder soveel PBS as moontlik.Gaan voort na stap 2.

1.1.3.Verskillende selkultuurskottel of 'n verwysingsnommer tabel 1-1 in 'n selkultuurskottel is voorafverkoelde 1 × PBS bygevoeg vir selwas.

Tabel 1-1: PBS-dosering vir verskillende getalle selle

Let wel:Om 'n stewige aanhangende selle te verseker，'n groot aantal sel verlies vermy wanneer was.

1.2.Suspensie-selle of aanhangende selle gekweek in nie-poreuse plate

1.2.1.Hechtende selle wat in nie-multiput plate gekweek is (suspensieselle begin vanaf die volgende stap 1.2.2), versamel en skei die selle volgens die normale selversamelingsmetode, en plaas dit in 'n kultuurplaat of sentrifugebuis;indien tripsinisering gebruik word, vereis sentrifugering om die selle te versamel en om oorblywende tripsien te verwyder, het PBS gehersuspendeerde selle in individuele selle bygevoeg om die selle te versprei.

1.2.2.Nadat die aantal selle getel is, is die selle 1×10 verdeel⁵ een om buise te sentrifugeer, versamel selle deur sentrifugering by 1000 × g vir 10 min.

1.2.3.Voeg 200 μl PBS by die sentrifugeerbuis, moenie herhaaldelik pipet nie, en aspireer die PBS direk.gaan voort na stap 2. (Indien dit moeilik is om te presipiteer en die selle is weer hersuspendeer, kan 1000×g 10 min. nadat die supernatant weggegooi is, 1000×g gesentrifugeer word, gaan die selkorrel voort na stap 2)

2.Sellise: Verwyder Buffer CL, sy temperatuur geëquilibreerd na kamertemperatuur, DNA Eraser en Foregene Protease Plus II, volgens die volgende tabel 1-2 voorbereide lisis stelsel: (Lise oplossing is gereed vir gebruik).

Tabel 1-2: splitsing stelsel voorbereiding (Let wel: in die voorbereiding op ys)

3.( 24-put plaat as 'n voorbeeld) Pipetteer 200 μl sellise meestermengsel in elke put, blaas herhaaldelik 5-10 keer, Inkubeer by kamertemperatuur (20-25 ℃) vir 5 min.

Let wel:Om die vorming van borrels te vermy, asseblief wanneer pipetskaal na 200μl of minder aangepas is.Die selle kan troebel lyk na lysis, wat normaal is.

4.(24-put plaat as 'n voorbeeld) word bygevoeg in die vloeistof 20 μl Buffer ST (verskillende lysisisteme Buffer ST bygevoeg in 'n hoeveelheid wat in Tabel 1-3 getoon word), 5-10 keer herhaal, by kamertemperatuur (20-25 ℃) is vir 2 min geïnkubeer.

Let wel:Die pipetpunt is onder die oppervlak geplaas, om te verseker dat die lysaat bygevoeg is，om die vorming van borrels te vermy, asseblief wanneer pipetskaal na 200μl of minder aangepas is.

Tabel 1-3:Voeg Buffer ST by

5.Die lysaat word gebruik vir daaropvolgende RT-qPCR eksperimente.As die daaropvolgende eksperimente nie betyds uitgevoer kan word nie, hou dit asseblief vir nie meer as 2 uur op ys nie, en stoor by -20 ℃ of -80 ℃ (nie meer as drie maande nie).

B: RT stelsel voorbereiding

1. Haal 5 × Direct RT Mix uit en plaas dit op 'n ysbad, laat dit natuurlik smelt, en meng dit liggies vir latere gebruik;haal RNase-Free ddH2O uit en smelt dit en plaas dit op 'n ysbad vir latere gebruik.Berei die reaksiestelsel op ys volgens Tabel 2-1 hieronder.

Tabel 2-1: Voorbereiding van RT-reaksiestelsel

2.Na voltooiing van sisteemformulering, liggies gemeng en kortliks sentrifugeer in die volgende tabel 2-2 reaksietoestande RT reaksie.

Tabel 2-2: RT Reaksie toestand instelling

3.Na voltooiing van die reaksie, is die reaksieproduk direk op ys geplaas vir qPCR, plaas asseblief die langtermynbewaring -20 ℃ of -80 ℃.

Let wel: As gevolg van die gebruik van nie-gesuiwerde sjabloon, kan wit neerslae in die omgekeerde transkripsieproduk voorkom.Dit is 'n normale verskynsel.Sentrifugeer die supernatant onmiddellik vir daaropvolgende eksperimente.

Die resulterende RT-reaksie-oplossing word by die volgende Stap Intydse PCR-reaksiestelsels gevoeg, dit word aanbeveel om hoeveelhede wat wissel van 10-30% van die reaksiestelsel by te voeg.

C: qPCR reaksie sisteem voorbereiding

1.Gepaste hoeveelheid B voorberei in stap cDNA-sjabloon volgens die volgende tabel 3-1 om 'n reaksiestelsel voor te berei.

Let wel: Die hoeveelheid cDNA-sjabloon maak 10-30% van die qPCR-stelsel uit.Byvoorbeeld, in 'n 20μl qPCR-stelsel, voeg 2-6 μl lysisbuffer by, maar nie meer as 6 μl nie.

2.Die optimalisering goeie qPCR toestande (Gloei temperatuur, ens.) vir qPCR reaksie (Die reaksie toestande gegee by Tabel 3-2).

Let wel: Probeer om geoptimaliseerde toestande vir qPCR-reaksies te gebruik om beter resultate te kry.

Tabel 3-1: Voorbereiding van PCR-reaksiestelsel

1*: Primer konsentrasie kan aangepas word in die reeks van 50-900 nM wanneer onderlaag reaksie prestasie swak is.

Let wel: Die qPCR-stelsel kan aangepas word volgens eksperimentele behoeftes en fluoressensie-siklusmodel.Vir qPCR in 'n 50μl stelsel, pas die reagensdosis proporsioneel aan volgens die 20μl stelsel.

2*: Kies die toepaslike finale konsentrasie van ROX Reference Dye volgens die fluoressensie kwantitatiewe termiese siklus.Die mees geskikte ROX-verwysingskleurstofkonsentrasies vir algemene fluoressensie-kwantitatiewe siklusse word in die tabel hieronder getoon:

Tabel 3-2: qPCR-reaksietoestande word verskaf

Let wel: Om die beste qPCR-effek te verkry, kan gradiënt-PCR gebruik word om die reaksietoestande vir verskillende templates en verskillende primers te optimaliseer.PCR-reaksietoestande wissel na gelang van die fluoressensie-ontleder, sjabloon, primer, ens. In die spesifieke operasie moet die optimale reaksietoestande ontwerp word volgens die spesifieke toestande van die fluoressensie-kwantitatiewe termiese sikleerder, sjabloontipe, grootte van die fragment van belang, basisvolgorde van die geamplifiseerde fragment en GC-inhoud en lengte van primers, insluitend reaksietyd, ens.

Real Time PCR primer ontwerp beginsels

Forward Primer en Reverse Primer

Vir Real Time PCR is onderlaagontwerp baie belangrik.Primers hou verband met die spesifisiteit en doeltreffendheid van PCR-amplifikasie, en kan ontwerp word met verwysing na die volgende beginsels:

◆ Onderlaaglengte: 18-30bp.

◆ GC-inhoud: 40-60%.

◆ Tm-waarde: Primer-ontwerpsagteware, soos Primer 5, kan die Tm-waarde van die onderlaag gee.Die Tm-waardes van die stroomop en stroomaf primers moet so na as moontlik wees.Die Tm-berekeningsformule kan ook gebruik word: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Wanneer PCR uitgevoer word, word 'n temperatuur onder die primer Tm-waarde van 5 °C oor die algemeen gekies as die uitgloeitemperatuur (die ooreenstemmende toename in die uitgloeitemperatuur kan die spesifisiteit van die PCR-reaksie verhoog).

◆ Primers en PCR-produkte:

◆ Ontwerp primer PCR amplifikasie produk lengte is verkieslik 100-150bp.

◆ Ontwerponderlaag in die sekondêre strukturele area van die sjabloon moet sover moontlik vermy word.

◆ Vermy die vorming van 2 of meer komplementêre basisse tussen die 3′-punte van stroomop- en stroomaf-primers.

◆ Primer 3′ terminale basis kan nie teenwoordig wees met 3 bykomende opeenvolgende G of C nie.

◆ Die primers self kan nie komplementêre strukture hê nie, anders sal 'n haarnaaldstruktuur gevorm word wat PCR-amplifikasie beïnvloed.

◆ ATCG moet so eweredig moontlik in die primer-volgorde versprei word, en die 3′-terminale basis moet vermy word as T.

Bylaag1:Cell DirekteRT-qPCR Kit komponentt aanvulling pak

1. Sel Lysis Oplossing