1. Aanvanklike begrip
Op hierdie stadium moet ons sommige konsepte en terminologie verstaan, om te verhoed dat ons foute voor ons seniors maak, soos:
V: Wat is die verskil tussen RT-PCR, qPCR, Real-time PCR en real-time RT-PCR?
Antwoord: RT-PKR is omgekeerde transkripsie PCR(omgekeerde transkripsie PCR, RT-PCR), wat 'n wyd gebruikte variant van polimerase kettingreaksie (PCR) is.In RT-PKR word 'n RNA-string omgekeerd getranskribeer in komplementêre DNA, wat dan as 'n templaat vir DNA-amplifikasie deur PCR gebruik word.
Real-time-PCR en qPCR(Kwantitatiewe Real-ltime-PCR) is dieselfde ding, albei is intydse kwantitatiewe PCR, wat beteken dat elke siklus van PCR intydse datarekords het, sodat die aantal beginsjablone presiese analise aangepas kan word.
Alhoewel beide intydse PCR (intydse fluoresserende kwantitatiewe PCR) en omgekeerde transkripsie PCR (omgekeerde transkripsie PCR) as RT-PCR afgekort word, is die internasionale konvensie: RT-PCR verwys spesifiek na omgekeerde transkripsiePCR , Real-time PCR word gewoonlik afgekort as qPCR (kwantitatiewe real-time PCR).
En intydse RT-PCR (RT-qPCR), dit is die omgekeerde transkripsie PCR gekombineer met die fluoresserende kwantitatiewe tegnologie: verkry eers cDNA (RT) van RNA-omgekeerde transkripsie, en gebruik dan intydse PCR vir kwantitatiewe analise (qPCR).Die meeste laboratoriums doen RT-qPCR, dit wil sê navorsing oor RNA-uitdrukking afregulering, so die qPCR waaroor almal in die laboratorium praat, verwys eintlik na RT-qPCR, maar moenie vergeet dat daar nog baie DNS-toetse in kliniese toepassings is nie.Kwantitatiewe ontleding, soos hepatitis B-virus HBV opsporing.
Vraag: Na die lees van baie fluoresserende kwantitatiewe PCR, hoekom moet die geamplifiseerde fragment binne die reeks van 80-300bp beheer word?
Antwoord: Die lengte van elke geenvolgorde is anders, sommige is etlike kb, sommige is honderde bp, maar ons hoef net te vereis dat die produklengte 80-300bp moet wees wanneer primers ontwerp word, te kort of te lank is nie geskik vir fluoresserende kwantitatiewe PCR-opsporing nie.Die produkfragment is te kort om van die primer-dimeer onderskei te word.Die lengte van die primer-dimeer is ongeveer 30-40bp, en dit is moeilik om te onderskei of dit 'n primer-dimeer is of 'n produk as dit minder as 80bp is.As die produkfragment te lank is, wat 300bp oorskry, sal dit maklik lei tot lae amplifikasie-doeltreffendheid en kan nie die hoeveelheid van die geen effektief opspoor nie.
As jy byvoorbeeld tel hoeveel mense in 'n klaskamer is, hoef jy net te tel hoeveel monde daar is.Dieselfde geld wanneer jy gene opspoor, jy hoef net 'n sekere volgorde van 'n geen op te spoor om voor te stel Die hele volgorde sal doen.As jy mense wil tel, moet jy beide monde en neuse, ore en brille tel, en dit is maklik om foute te maak.
Om uit te brei, in biologiese navorsing, is daar baie navorsingsgevalle van punt tot gebied, omdat die geenvolgorde van enige spesie baie lank is, is dit onnodig en onmoontlik om alle fragmente te meet, soos bakteriële 16S-volgordebepaling, wat is om die konserwatiewe volgorde van bakterieë uit te voer Assays om die aantal van 'n sekere populasie van bakterieë af te lei.
V: Wat is die optimale lengte vir qPCR-onderlaagontwerp?
Antwoord: Oor die algemeen is die onderlaaglengte ongeveer 20-24bp, wat beter is.Natuurlik moet ons aandag gee aan die TM-waarde van die primer wanneer die primer ontwerp word, want dit hou verband met die optimale uitgloeitemperatuur.Na baie eksperimente is dit bewys dat 60°C 'n beter TM-waarde is.As die uitgloeitemperatuur te laag is, sal dit maklik lei tot nie-spesifieke amplifikasie.As die uitgloeitemperatuur te hoog is, sal die versterkingsdoeltreffendheid relatief laag wees, die piek van die versterkingskurwe sal later begin, en die CT-waarde sal vertraag word.
V: Hoe verskil die kleurstofmetode van die sondemetode?
Antwoord: KleurstofmetodeSommige fluoresserende kleurstowwe, soos SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ens., straal nie lig uit op sigself nie, maar sal fluoressensie uitstraal nadat dit aan die klein groef van dubbelstring DNA gebind is.Daarom, aan die begin van die PCR-reaksie, kan die masjien nie die fluoresserende sein opspoor nie.Wanneer die reaksie die uitgloei-verlengingstadium bereik, word die dubbelstring oopgemaak, en 'n nuwe string word gesintetiseer onder die werking van DNA-polimerase, en die fluoresserende molekule bind aan die dsDNA-kleingroef.Soos die aantal PCR-siklusse toeneem, word meer en meer kleurstowwe gekombineer met dubbelstring-DNS, en die fluoresserende sein word ook voortdurend verbeter.Die kleurstofmetode word hoofsaaklik in wetenskaplike navorsing gebruik.
NS: Wees versigtig wanneer jy die eksperiment doen, die kleurstof moet gekombineer word met menslike DNA, wees versigtig om dit in 'n fluoresserende persoon te verander.
Kleurstofmetode (links) Sondemetode (regs)
NS: Wees versigtig wanneer jy die eksperiment doen, die kleurstof moet gekombineer word met menslike DNA, wees versigtig om dit in 'n fluoresserende persoon te verander.
SYBR Groen Ⅰ bind aan die klein groef van DNA
Sonde metodeTaqman-sonde is die mees gebruikte hidrolise-sonde.Daar is 'n fluoresserende groep aan die 5'-punt van die sonde, gewoonlik FAM, en die sonde self is 'n volgorde komplementêr tot die teikengeen.Daar is 'n fluoresserende blusgroep aan die 3′-punt.Volgens die beginsel van fluoressensie-resonansie-energie-oordrag (Förster-resonansie-energie-oordrag, FRET), wanneer die verslaggewer fluoresserende groep (skenker fluoresserende molekule) en die blus fluoresserende groep (akseptor fluoresserende molekule) opgewek word Wanneer die spektra oorvleuel en die afstand van die donor fluorescerende blik baie naby is (7-10 van die fluorescerende buis), die akseptormolekule, terwyl die outofluoressensie verswak word.Daarom, aan die begin van die PKR-reaksie, wanneer die sonde vry en ongeskonde in die sisteem is, sal die verslaggewer fluoresserende groep nie fluoressensie uitstraal nie.Tydens uitgloeiing bind die onderlaag en sonde aan die sjabloon.Tydens die verlengingstadium sintetiseer die polimerase voortdurend nuwe kettings.DNA-polimerase het 5′-3′ eksonuklease-aktiwiteit.Wanneer die sonde bereik word, sal die DNA-polimerase die sonde vanaf die sjabloon hidroliseer, die verslaggewer fluoresserende groep skei van die uitblus fluoresserende groep, en die fluoresserende sein vrystel.Aangesien daar 'n een-tot-een-verhouding tussen die sonde en die sjabloon is, is die sondemetode beter as die kleurstofmetode in terme van die akkuraatheid en sensitiwiteit van die toets.Die sondemetode word hoofsaaklik in diagnose gebruik.
V: Wat is absolute kwantifisering?Wat is relatiewe kwantifisering?
Antwoord: Absolute kwantifisering verwys na die berekening van die aanvanklike kopiegetal van die monster wat deur qPCR getoets moet word, soos hoeveel HBV-virusse in 1 ml bloed is.Die resultaat verkry deur relatiewe kwantifisering is die verandering in die hoeveelheid van die teikengeen in 'n spesifieke monster relatief tot 'n ander verwysingsmonster, en die geenuitdrukking word op- of af-gereguleer.
V: Sal die hoeveelheid RNA-ekstraksie, omgekeerde transkripsie-doeltreffendheid en amplifikasie-doeltreffendheid die eksperimentele resultate beïnvloed?
V: Sal monsterberging, ekstraksie-reagense, omgekeerde transkripsie-reagense en ligoordragende verbruiksgoedere die eksperimentele resultate beïnvloed?
V: Watter metode kan die eksperimentele data regstel?
Met betrekking tot hierdie kwessies, sal ons dit in detail beskryf in die gevorderde en gevorderde afdelings hieronder.
2. Gevorderde kennis
Met betrekking tot intydse fluoresserende kwantitatiewe PCR, moet ons die realiteit erken dat duisende wetenskaplike navorsingsartikels elke jaar gepubliseer word, waaronder die fluoresserende kwantitatiewe PCR-tegnologie nie 'n klein getal is nie.
As daar geen algemene standaard is om die fluoresserende kwantitatiewe PCR-eksperiment te meet nie, kan die resultate baie verskil.Vir dieselfde geen van dieselfde spesie, met dieselfde verwerkingsmetode, sal die opsporingsresultate ook baie verskil, en dit sal moeilik wees vir laatkommers om dieselfde resultate te herhaal.Jy Niemand weet wat is reg en wat is verkeerd nie.
Beteken dit dat fluoresserende kwantitatiewe PCR 'n cheat-tegnologie of 'n onbetroubare tegnologie is?Nee, dit is omdat fluoresserende kwantitatiewe PCR meer sensitief en meer akkuraat is, en 'n bietjie verkeerde operasie sal heeltemal teenoorgestelde resultate lewer.’n Klein verlies is duisend myl ver.Die skrywer van die artikel kan herhaaldelik deur die resensente gemartel word.Terselfdertyd is die resensente van die joernaal ook moeilik om uit verskillende eksperimentele resultate te kies.
Alles in ag genome, dui op 'n gebrek aan konsensus in intydse PCR-eksperimente.Vir hierdie doel het senior wetenskaplikes in die bedryf begin om standaarde te formuleer,wat vereis dat bydraers 'n paar nodige eksperimentele en dataverwerkingsbesonderhede (insluitend nodige data) in die artikel verskaf om aan hierdie standaarde te voldoen.
Beoordelaars kan die kwaliteit van die eksperiment beoordeel deur hierdie besonderhede te lees;toekomstige lesers kan dit ook gebruik om die eksperiment te herhaal of die eksperiment te verbeter.Dan is die eksperimentele resultate wat op hierdie manier verkry word vol inligting, van hoë gehalte en bruikbaar.
MIBBI (Minimum Inligting vir Biologiese en Biomediese Ondersoeke -http://www.mibbi.org) tot stand gekom het.MIBBI is 'n projek wat standaarde vir eksperimente verskaf.Dit word in die natuur gepubliseer.Hierdie projek is gemik op verskeie biologiese eksperimente, insluitend selbiologie, Microarray, qPCR wat ons nou gaan bespreek, ens., en maak voorsiening vir elke tipe eksperiment wanneer manuskripte ingedien word.Daardie inligting moet te alle tye verskaf word.
In die MIBBI-projek is daar twee artikels wat verband hou met fluoresserende kwantitatiewe PCR, naamlik:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – 'n gestruktureerde taal- en verslagdoeningsgids vir intydse kwantitatiewe PCR-data;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – minimum inligting vir die publikasie van artikels oor intydse kwantitatiewe PCR-eksperimente.
Kom ons praat eers oor RDML, die terminologiespesifikasie.
As daar nie 'n standaarddefinisie vir alles is nie, is dit onmoontlik om die bespreking voort te sit, en daarom is die verduideliking van terme so belangrik in die eksamen.
Die terminologie wat in die fluoresserende kwantitatiewe PCR-eksperiment gebruik word, sluit die volgende inhoud in.QIAGEN het die beste opsomming vir ons gemaak.Die volgende is almal drooggoedere .
Versterkingskurwe
Die amplifikasiekurwe verwys na die kurwe wat tydens die PKR-proses gemaak is, met die siklusnommer as die abskis en die intydse fluoressensie-intensiteit tydens die reaksie as die ordinaat.
'n Uitstekende versterkingskromme behoort die volgende kenmerke te hê: die basislyn is plat of effens afgeneem, en daar is geen duidelike opwaartse neiging nie;die buigpunt van die kromme is duidelik, en die helling van die eksponensiële fase is eweredig aan die versterkingsdoeltreffendheid.Hoe groter die helling, hoe hoër is die versterkingsdoeltreffendheid;die algehele versterkingskromme Die parallelisme is goed, wat aandui dat die versterkingsdoeltreffendheid van elke buis soortgelyk is;die eksponensiële fase van die amplifikasiekurwe van lae-konsentrasie monsters is voor die hand liggend.
Basislyn (Basislyn)
Die basislyn is die geraasvlak van die vroeë siklus, gewoonlik gemeet tussen die 3de en 15de siklus, omdat die fluoressensiewaardeverhoging wat veroorsaak word deur die amplifikasieproduk nie gedurende hierdie tydperk opgespoor kan word nie.Die aantal siklusse wat gebruik word om die basislyn te bereken kan gevarieer word en moet dalk verminder word as hoë sjabloonhoeveelhede gebruik word of as die uitdrukkingsvlak van die teikengeen hoog is.
Die opstel van die basislyn vereis die besigtiging van fluoressensiedata vanaf die lineariteitsversterkingskurwe.Die basislyn is so gestel dat die groei van die versterkingskurwe begin met 'n siklusgetal groter as die basislynsiklus se topgetal.Basislyne moet individueel vir elke teikenvolgorde gestel word.Die gemiddelde fluoressensiewaardes wat in die vroeë siklusse opgespoor is, moet afgetrek word van die fluoressensiewaardes wat in die geamplifiseerde produkte verkry is.Die nuutste weergawes van verskeie Real-Time PCR-sagteware laat outomatiese optimalisering van basislyninstellings vir individuele monsters toe.
Gedurende die eerste paar siklusse van die PCR-amplifikasiereaksie verander die fluoressensiesein nie veel nie.Om 'n reguit lyn te nader, word die basislyn genoem, maar as ons noukeurig na die eerste paar siklusse kyk, sien ons dat binne die basislyn is wat in die prent hieronder gebeur.
Agtergrond Agtergrond verwys na
die nie-spesifieke fluoressensiewaarde in die reaksie.Byvoorbeeld: ondoeltreffende fluoressensie-blus;of 'n groot aantal dubbelstring-DNS-template as gevolg van die gebruik van SYBR Green.Die agtergrondkomponente van die sein word wiskundig verwyder deur die Real-Time PCR sagteware algoritme.
Verslaggewer sein
Verslaggewersein verwys na die fluoresserende sein wat gegenereer word deur SYBR Green of fluoresserend gemerkte volgorde-spesifieke probes tydens Real-Time PCR.
Genormaliseerde verslaggewersein (RN)
RN verwys na die fluoressensie intensiteit van die verslaggewer kleurstof gedeel deur die fluoressensie intensiteit van die passiewe verwysing kleurstof gemeet by elke siklus.
Passiewe verwysingskleurstof
In sommige Real-Time PCR's,die fluoresserende kleurstof ROX word as 'n interne verwysing gebruik om die fluoresserende sein te normaliseer.Dit korrigeer vir variasies as gevolg van onakkurate pipettering, putposisie en fluoressensie-skommelings op 'n goed-vir-put basis.
Die fluoressensie drempel (drempel)
is aangepas bo die agtergrondwaarde en aansienlik onder die platowaarde van die versterkingskurwe.Dit moet in die lineêre gebied van die amplifikasiekurwe lê, wat die log-lineêre reeks van PKR-opsporing verteenwoordig.Drempels moet in die log-amplifikasie-kurwe-aansig gestel word sodat die log-lineêre fase van PCR maklik identifiseerbaar is.As daar veelvuldige teikengene in Real-Time PCR is, moet die drempel vir elke teiken gestel word.Oor die algemeen word die fluoressensiesein van die eerste 15 siklusse van PCR-reaksie as die fluoressensie-agtergrondsein gebruik, en die fluoressensie-drempel is 10 keer die standaardafwyking van die fluoressensie-sein van die eerste 3 tot 15 siklusse van PCR, en die fluoressensie-drempel van die PCR-amplifikasiefase word ingestel.Oor die algemeen het elke instrument sy fluoressensiedrempel ingestel voor gebruik.
Siklusdrempel (CT) of kruispunt (CP)
Die siklus waarteen die amplifikasiekromme die drempel oorskry (dws die punt waarop fluoressensie-opsporing aansienlik toeneem).CT kan 'n breuk wees en die hoeveelheid beginsjabloon kan bereken word.Die CT-waarde verteenwoordig die aantal siklusse wat ervaar word wanneer die fluoresserende sein in elke PCR-reaksiebuis die vasgestelde drempel bereik.Daar is 'n lineêre verband tussen die CT-waarde van elke sjabloon en die logaritme van die aanvanklike kopienommer van die sjabloon, diehoër die aanvanklike kopiegetal, hoe kleiner die CT-waarde, en omgekeerd.'n Standaardkurwe kan gemaak word deur 'n standaard met 'n bekende aanvanklike kopiegetal te gebruik, waarin die abskis die CT-waarde verteenwoordig, en die ordinaat die logaritme van die aanvanklike kopiegetal verteenwoordig.Dus, solank as wat die CT-waarde van die onbekende monster verkry word, kan die aanvanklike kopiegetal van die monster uit die standaardkromme bereken word.
ΔCT waarde
ΔCT waarde beskryfdie verskil tussen die teikengeen en die ooreenstemmende endogene verwysingsgeen-CT-waarde, soos 'n huishoudelike geen, en word gebruik om die hoeveelheid sjabloon wat gebruik word te normaliseer:
⇒ΔCT = CT (teikengeen) – CT (endogene verwysingsgeen)
ΔΔCT-waarde
Die ΔΔCT waarde beskryf die verskil tussen die gemiddelde ΔΔCT waarde van 'n monster van belang (bv. gestimuleerde selle) en die gemiddelde ΔΔCT waarde van 'n verwysing monster (bv. ongestimuleerde selle).Die verwysingsmonster word ook die kalibrasiemonster genoem en alle ander monsters word hiertoe genormaliseer vir relatiewe kwantifisering:
⇒ΔΔCT = gemiddelde ΔCT (steekproef van belang) – gemiddelde ΔCT (verwysingsteekproef)
Endogene verwysingsgene (endogene verwysingsgene)
Die uitdrukkingsvlakke van endogene verwysingsgene, soos huishoudingsgene (huishoudingsgene), verskil nie tussen monsters nie.Deur die CT-waardes van die verwysingsgeen met die teikengeen te vergelyk, kan die uitdrukkingsvlak van die teikengeen genormaliseer word na die hoeveelheid inset-RNA of cDNA (sien die afdeling oor ΔCT-waardes hierbo).
Interne verwysingsgene korrek virmoontlike RNA-afbraak of die teenwoordigheid van ensiem-inhibeerders in RNA-monsters, sowel as variasies in RNA-inhoud, omgekeerde transkripsie-doeltreffendheid, nukleïensuurherwinning en monsterhantering.Om die optimale verwysingsgeen(s) te kies, het ons die algoritme aangepas om die keuse van die optimale verwysing afhanklik van die eksperimentele omgewing moontlik te maak.
Interne beheer
'n Kontrolevolgorde wat in dieselfde reaksie as die teikenvolgorde geamplifiseer word en met 'n ander sonde ondersoek word (dws deur dupleks-PKR uit te voer).Interne kontroles word dikwels gebruik om mislukte versterkings uit te sluit, soos wanneer die teikenvolgorde nie opgespoor word nie.
Kalibrasie monster
'n Verwysingsmonster (byvoorbeeld, gesuiwerde RNA van 'n sellyn of weefsel) wat in relatiewe kwantifisering gebruik word om alle ander monsters te vergelyk om die relatiewe uitdrukkingsvlak van 'n geen te bepaal.Die kalibrasiemonster kan enige monster wees, maar is gewoonlik 'n kontrole (byvoorbeeld 'n onbehandelde monster of 'n monster vanaf tyd nul van die eksperiment).
Positiewe kontroles
gebruik beheerreaksies metbekende hoeveelhede sjabloon.Positiewe kontroles word dikwels gebruik om te kyk of 'n primer-stel of primer-probe-stel behoorlik werk en dat die reaksie korrek opgestel is.
Geen sjabloonbeheer (NTC)
'n Kontrolereaksie wat al die nodige komponente van die amplifikasiereaksie bevat behalwe die sjabloon, wat gewoonlik met water vervang word.Die gebruik van NTC kan die kontaminasie vind wat veroorsaak word deur reagensbesoedeling of vreemde DNA, om sodoende die egtheid en betroubaarheid van die opsporingsdata te verseker.Versterking van die NTC-beheer dui op kontaminasie.
Geen RT-beheer (NRT)
RNA-ekstraksieproses kan oorblywende genomiese DNA bevat, wat uiters skadelik is en die skuldige is wat datakwaliteit en die natuurlike vyand van qPCR beïnvloed, dus wanneer eksperimente ontwerp word, moet dit ontwerp word om slegs RNA-opsporing te versterk.Daar is twee maniere, een is om primers oor introne te ontwerp, die ander is om DNA heeltemal te verwyder, watter een is beter, wat later bespreek sal word.Die NTR-beheer is 'n towerspieël om DNS-besoedeling op te spoor.As daar versterking is, beteken dit dat daar besoedeling is.
Standaarde
Standaarde is monsters van bekende konsentrasie of kopiegetal wat gebruik word om 'n standaardkromme te konstrueer.Om die stabiliteit van die standaard te verseker, word die geenfragment gewoonlik in die plasmied gekloneer en as die standaard gebruik.
Die standaardkromme
word gewoonlik verdun in ten minste 5 konsentrasiegradiënte met die standaardproduk volgens die verdubbelingsverhouding, en 5 punte word in die koördinate van CT-waarde en kopiegetal geteken, en die punte word verbind om 'n lyn te vorm om 'n standaardkromme te genereer.Vir elke standaardkurwe moet die geldigheid daarvan nagegaan word.Die hellingwaarde val tussen –3.3 en –3.8, en elke konsentrasie word in drievoud uitgevoer.Punte wat aansienlik verskil van ander punte moet weggegooi word.Die CT-waarde van die monster wat getoets moet word, word in die standaardkurwe ingebring, en die uitdrukkingsvlak van die monster wat getoets moet word, kan bereken word.
Die CT-waarde van die monster wat getoets moet word, word in die standaardkurwe ingebring, en die aanvanklike kopienommer van die monster wat getoets moet word, kan bereken word.
Doeltreffendheid en Helling
Die helling van die standaardkromme verteenwoordig die doeltreffendheid van intydse PCR.
·'n Helling van -3.322 dui aan dat die PCR-amplifikasie-doeltreffendheid 1, of 100% doeltreffend is, en die hoeveelheid PCR-produk verdubbel by elke siklus.
· 'n Helling minder as –3.322 (bv. –3.8) dui op 'n PKR-doeltreffendheid
· 'n Helling groter as –3.322 (bv. –3.0) dui aan dat die PCR doeltreffendheid groter as 100% blyk te wees, wat nuuskierig is, hoe kan een siklus van PCR meer as dubbel die geamplifiseerde produk genereer?Hierdie situasie vind plaas in die nie-lineêre fase van die PKR-reaksie, dit wil sê daar is 'n groot hoeveelheid nie-spesifieke amplifikasie.
smeltkurwe
Nadat die qPCR-amplifikasie voltooi is, word die PCR-produk verhit.Soos die temperatuur styg, smelt die dubbelstring-amplifikasieproduk geleidelik, wat 'n afname in fluoressensie-intensiteit tot gevolg het.Wanneer 'n sekere temperatuur (Tm) bereik word, sal 'n groot aantal produkte smelt.Fluoresentasie daal skerp.Verskillende PCR-produkte het verskillende Tm-waardes en verskillende smelttemperature, sodat die spesifisiteit van PCR geïdentifiseer kan word.
Smeltkromme (afgeleide kurwe)
Die smeltkurwe word afgelei om 'n piekkaart te vorm, wat die situasie van PCR-produkfragmente meer intuïtief kan vertoon.Aangesien die smelttemperatuur die Tm-waarde van die DNA-fragment is, kan sommige parameters wat die Tm-waarde van die DNA-fragment beïnvloed, beoordeel word, soos fragmentgrootte, GC-inhoud, ens. Oor die algemeen, volgens ons primerontwerpbeginsels,die lengte van die versterkte produk is in die reeks van 80-300bp, dus moet die smelttemperatuur tussen 80°C en 90°C wees.
Interpretasie van die smeltkurwe: As die enigste hoofpiek tussen 80°C-90°C verskyn, beteken dit dat die fluoresserende kwantitatiewe PCR perfek is;as die hoofpiek tussen 80°C-90°C verskyn en diverse pieke onder 80°C verskyn, word die primer dimeer basies oorweeg.Jy kan probeer om die uitgloeitemperatuur te verhoog om dit op te los;as die hoofpiek tussen 80°C-90°C verskyn, en die diverse piek verskyn weer wanneer die temperatuur styg, word basies beskou dat daar DNS-besmetting is, en DNS moet in die aanvanklike stadium van die eksperiment verwyder word.
Natuurlik is daar nog 'n paar abnormale situasies, wat hieronder een vir een afgebreek sal word.
3. Gevorderde kennis
Om qPCR te doen, moet ek sê MIQE,Minimum inligtingvir publikasie vanKwantitatiefIntydse PCREksperimente - die minimum inligting vir die publikasie van artikels oor intydse kwantitatiewe PCReksperimente.Om almal se begrip te vereenvoudig, sal ons die sleutelinhoud vereenvoudig.
Jy kan die oorspronklike teks van MIQE op die internet deursoek, en die belangrikste ding is dat dit diedata kontrolelys wat verskaf moet word wanneer 'n artikel gepubliseer word .
Beoordelaars kan die kwaliteit van die eksperiment beoordeel deur hierdie besonderhede te lees;toekomstige lesers kan dit ook gebruik om die eksperiment te herhaal of te verbeter.
Dit is opmerklik dat in hierdie lys die belangrikheid van elke lys onderskeidelik met E of D gemerk is.Wat beteken dit?E: noodsaaklike inligting (moet ingedien word);D: wenslike inligting (verskaf soveel as moontlik).
MIQE (1)—Eksperimentele Ontwerp
Baie skelms wat hul verdediging voltooi het nadat hulle hul nagraadse studies voltooi het, sal nie weet hoe om 'n eksperiment onafhanklik te ontwerp, hul notaboeke oop te maak en te doen wat die onderwyser vir hulle sê om te doen nie.Gevolglik was die eksperimentele ontwerp nie streng nie, en die redaksionele afdeling van die tydskrif het gesê dat hulle hierdie prent en daardie prent wou opmaak, en daarom het hulle dit in 'n dwaas gedoen.Dit is hoe die skelms gemaak word!
Nader aan die huis is die eerste beginsel van die eksperiment om te bepaaldie strengheid van die eksperimentele logika.Die mees fundamentele ding is die eksperimentele ontwerp, en die belangrikste ding oor die eksperimentele ontwerp is hoe om die teikenmonster, verwysingsteekproef (kontrole) en die aantal herhalings te stel, sodat die eksperimentele data na verwys, vergelykbaar en oortuigend kan wees.
Die teikenmonsterverwys na die monster wat vereis dat ons die teikengeen na 'n sekere behandeling moet opspoor.Die verwysingsmonsteris die monster sonder enige behandeling, waarna in biologie dikwels na verwys word as wilde tipe.
Eksperimentele herhalingsis baie belangrik.Oor die algemeen moet die aantal oortuigende herhalings meer as drie wees.Dit is nodig om te onderskei wat biologiese replikasie en wat tegniese replikasie is.
Biologiese herhalings: Dieselfde verifikasie eksperiment gedoen met verskillende materiale (tyd, plante, groepe, reaksieplate).
Biologiese duplisering
Kom ons neem die plaagdoderbehandeling van peper as voorbeeld.Ons wil plaagdoders op die drie plante van ABC spuit, dan is die drie plante van ABC drie biologiese replikate, en dit is dieselfde verifikasie-eksperiment wat met verskillende materiale uitgevoer is.Maar as 'n eksperiment is 'n kontrole beslis nodig, dus kan ons een van die takke van plant A spuit om 'n eksperimentele groep van plant A te vorm, en nie die ander takke van plant A spuit om 'n kontrolegroep te vorm nie.Doen dieselfde vir B en C.
Tegniese herhalings (tegniese herhalings): Dit is 'n herhaalde eksperiment wat ontwerp is om foute te vermy wat deur operasie veroorsaak word, wat eintlik 'n duplikaatgat is wat in dieselfde materiaal ingesluit is.Beide behandelings en kontroles moet herhaalde instellings (minimum drie) van die teikengeen en die interne verwysingsgeen hê.
Tegniese herhaling
Neem weer die soetrissie wat met plaagdoders behandel is as voorbeeld.Vir die eksperimentele groep van plant A het ons drie PKR-gate van 1, 2 en 3 gemaak vir onderskeidelik sy teikengeen en interne verwysingsgeen, om die gemiddelde na die opsporing te neem.Vir die beheer van plant A word groepe ook op dieselfde manier behandel.Doen dieselfde behandeling vir B- en C-plante.Dit is tegniese herhaling.
Dit is die moeite werd om daarop te letwat die statistieke binnekom, is die biologiese herhaling, en die tegniese herhaling is om te toets of daar enige willekeurige verskynsels in die eksperimentele proses is, om sodoende die eksperimentele resultate geloofwaardig te maak, dit wil sê om foute te vermy deur hul gemiddelde te neem soos ons dikwels sê.
Negatiewe kontroles—NTC en NRT
NTC (Geen-sjabloonbeheer), 'n kontrole sonder 'n sjabloon, word gebruik om te verifieer of die eksperimentele materiaal besmet is.Oor die algemeen word water as 'n sjabloon gebruik.As daar 'n fluoresserende reaksie is, dui dit aan dat nukleïensuurkontaminasie in die laboratorium plaasgevind het.
Hierdie besoedeling kom van: onsuiwer water, ongekwalifiseerde reagense wat endogene DNA bevat, primer besoedeling, laboratorium toerusting besoedeling, aërosol besoedeling, ens., moet RNase aasvangers en RNase inhibeerders gebruik.Aërosolbesoedeling is die moeilikste om te vind.Stel jou voor jou laboratorium is soos rookmis, met verskeie nukleïensure wat in die lug gesuspendeer is.
NRT (No-Reverse Transcriptase), die kontrole sonder omgekeerde transkripsie, is die nie-omgekeerde getranskribeerde RNA as 'n negatiewe kontrole, wat die kontrole van gDNA-residu is.
Wanneer geenuitdrukking gedoen word, word die hoeveelheid RNA opgespoor deur die hoeveelheid cDNA na omgekeerde transkripsie op te spoor.As daar gDNA-residu is wanneer RNA gesuiwer word, sal dit foute in die eksperimentele resultate veroorsaak, want die werklike resultate wat verkry word, is gDNA en cDNA.Op die totale vlak, nie net cDNA nie, moet gDNA heeltemal verwyder word tydens RNA-ekstraksie.
MIQE (2)—voorbeeld inligting
Die sogenaamde voorbeeldinligting beteken dat wanneer ons 'n artikel oor qPCR publiseer, ons die voorbeeldinligting duidelik moet verduidelik, wat 'n onontbeerlike deel van die artikel is.Net so, wanneer ons monsters verwerk, moet ons ook ons eie bedrywighede reguleer om die geldigheid van die monsters te verseker.
Die beskrywing van die monster is slegs 'n resultaat, en ons moet meer aandag gee aan die materiaal wat tydens die hele eksperiment geneem is.
Seleksie van eksperimentele materiale
Bloedmonsters – kies vars bloed, nie meer as 4 uur nie.Selmonsters – kies om vars selle in 'n tydperk van sterk groei te versamel.Diereweefsel—Kies vars, kragtig groeiende weefsel.Plantweefsel – Kies vars, jong weefsel.
Jy het seker opgelet dat daar 'n sleutelwoord in hierdie paar sinne is: vars .
Vir bogenoemde monsters is die beste, kostedoeltreffende en stabiele stel op die mark Foregene se kit, wat vinnig en maklik hul DNA en RNA kan onttrek.
Plant Total RNA Isolation Kit Plus
Berging van eksperimentele materiale
Oor die algemeen beveel ons nie aan om monsters te stoor as toestande dit toelaat nie.Daar is egter baie vriende wat nie onmiddellik na monsterneming eksperimente kan uitvoer nie, en sommige moet selfs vloeibare stikstoftenks na die veld dra vir monsterneming.
Vir hierdie soort hardwerkende vriend kan ek net sê dat jy nie reagensverbruiksgoedere verstaan nie.Nou produseer baie reagensverbruikbare maatskappye reagense wat RNA-monsters by kamertemperatuur kan stoor, en jy kan kies om dit te gebruik.Die konvensionele bergingsmetode is vloeibare stikstofberging, met behulp van 'n klein vloeibare stikstoftenk wat maklik is om te dra.Nadat u die monster teruggebring het na die laboratorium, stoor dit in 'n -80°C yskas.
Vir eksperimente wat RNA behels, moet die seswoord-beginsel gevolg word:lae temperatuur, geen ensieme,envinnig .
Die konsep van lae temperatuur is maklik om te verstaan;sonder ensieme is RNase oral in die wêreld waarin ons leef (anders sou jy deur MIV doodgemaak gewees het), so hoe om RNase te vermy wanneer eksperimente gedoen word, is 'n baie belangrike konsep;vinnig,Daar is geen Kung Fu in die wêreld wat nie gebreek kan word nie, net spoed kan nie gebreek word nie.
Daarom, in 'n sekere sin, hoe korter die onttrekkingstyd, hoe beter is die stel.Hoekom doenVoorgenese kit beklemtoon spoed, want hulle weet dit goed.
NS: Sommige meisies doen eksperimente baie versigtig, maar hulle is nie so goed soos 'n slam dunk na 'n paar jaar se werk nie.Hulle voel dat God onregverdig is, kla oor ander en soek na lewe.Eintlik het sy dit nie verstaan nie.Hy het die RNA nie goed beskerm nie, en die slam dunk-speler was flink.Toe hy die eksperiment gedoen het, het hy gedink dat hy die slam dunk met drie keer, vyf keer en twee afdelings sou voltooi, maar hy het die eksperiment goed gedoen.
Let wel: Stadiger, meer kanse op RNase-inval.Hoe om jouself op te lei om vinnig te wees?Daar is geen manier nie, oefen net meer.
Vir verskillende eksperimente en verskillende monsters is dit steeds nodig om meer literatuur te lees en 'n geskikte metode vir verwerking te kies.Vir die monsterversameling en bergingsproses vereis MIQE dat dit duidelik in die vraestel geskryf moet word, sodat die beoordelaars die betroubaarheid van die vraestel kan hersien, en dit is ook gerieflik vir die verstomde jongmense om jou eksperiment te herhaal.
Alhoewel biologiese eksperimente moeilik is, is dit hoogstaande.As jy nie versigtig is nie, kan jy die wêreld omverwerp.Byvoorbeeld, om SARS in 'n biochemiese krisis te maak, of om basterrys te maak om 1,3 miljard mense te red.Die prentjie hieronder is 'n chemiese eksperiment, jy behoort te verstaan hoe trots jy op jou navorsing is net deur na sy pielagtige voorkoms te kyk.Vergeet dit, moenie hom swart maak nie.
MIQE (3) – nukleïensuurekstraksie.
Nukleïensuur-ekstraksie is 'n groot gebeurtenis, en alle molekulêre biologie-eksperimente begin met nukleïensuur-ekstraksie.Eerstens, kom ons kopieer MIQE se inhoud oor nukleïensuurekstraksie.
As jy na hierdie vorm kyk, kan jy nie op die oppervlak bly nie.Die vorm is 'n dogma.Om 'n topstudent te wees, moet jy vra hoekom.Die wesenlike inhoud van hierdie tabel is: Streef nadie suiwerheid, integriteit, konsekwentheid en ekstraksiehoeveelheid van RNA .
Die eerste deel van dieproses of instrument is die nukleïensuur-ekstraksiestap.As jy 'n outomatiese nukleïensuuronttrekking gebruik om te onttrek (gevorderd, kontak my asseblief vir aankoop), moet jy die modelnaam van die instrument aandui.
Die naam van die kit en
watter stel gebruik is vir die veranderingsbesonderhede, watter spesiale reagense bygevoeg is of watter spesiale bewerkings gedoen is, moet duidelik verduidelik word sodat ander maklik jou eksperiment kan herhaal.
Sommige mense voeg 'n paar spesiale reagense by wanneer spesiale monsters onttrek word, en dink dat dit hul geheime wapen is en vertel dit nie aan ander nie.Terwyl hulle dit geheim hou, verloor hulle ook die geleentheid om jou artikel te laat skyn.Moenie slim wees nie, jy moet eerliker wees as die land ou Zhang in wetenskaplike navorsing, as jy slim wil wees, sal die artikel jou dom maak.
moet die produknommer van die kit onthouwanneer jy die kit bestel en die artikel skryf.Daar is oor die algemeen twee nommers op die stel: Kat-katalogusnommer (produknommer, artikelnommer), Lot-produk lotnommer (Gebruik om aan te dui uit watter bondel die produk kom).
Daarbenewens word die CAS-nommer dikwels gebruik wanneer biochemiese reagense bestel word, en ek sal dit saam populariseer.Die CAS-nommer is die nommer wat deur die American Chemical Society aan elke nuwe chemiese middel gegee word.Oor die algemeen word drie getalle met 'n streep verbind.Rushui se CAS-nommer: 7732-18-5.Chemikalieë het dikwels veelvuldige aliasse, maar die CAS-nommer is uniek.Wanneer u medisyne bestel, kan u eers die CAS-nommer daarvan nagaan.
Nader aan die huis, hoekom moet ons hierdie dinge duidelik beskryf?Trouens, dit is ook om die kwaliteit van RNA-ekstraksie na te gaan.Die gebruik van instrumente en stelle sal RNA-ekstraksie meer konsekwent maak.Die ekstraksieskaal van gewone laboratoriums is nie groot nie, en dit kan met kits verkry word.
Die besonderhede van DNase- of RNase-behandeling
Die belangrike kwessie van fluoresserende kwantitatiewe PCR is om DNA-besmetting te voorkom, en moenie eksperimenteer as daar kontaminasie is nie.Daarom is dit noodsaaklik om die proses te noem wat jy gebruik het om die DNA te verwerk, om te demonstreer dat die DNA in die eksperimentele proses heeltemal en heeltemal verwyder is.voorgestel deur 'n skematiese diagram.
Skematiese diagram van RNA en DNA
Oor die algemeen is die metode vir die verwydering van DNA om RNA te behandel met DNase na ekstraksie.Dit is egter relatief ou metodes.Kommersiële RNA-ekstraksiestelle kon DNA tydens die ekstraksieproses verwyder sonder om DNase by te voeg.Byvoorbeeld, 'n reeks kits van Foregene.
Let wel: Die verwydering van DNA tydens RNA-ekstraksie is 'n baie gevaarlike tweesnydende swaard, wat die werkingstyd van RNA-ekstraksie sal verleng en die risiko van RNA-afbraak sal verhoog.Basies is dit 'n afweging tussen RNA-opbrengs en suiwerheid.
Daarbenewens is die hoeveelheid DNase wat by die silika-gebaseerde adsorpsiekolom gevoeg word, baie klein, en hoë kwaliteit DNase moet gebruik word om die effek te bereik.Ongeoptimaliseerde DNase kan nie vinnig en volledig verteer word nie.Dit is 'n toets van die handelaar se tegniese vlak.Natuurlik is daar selfs meer vreemde handelaars wat spog dat DNA sonder DNase verwyder kan word.Daar kan gesê word dat enigiemand wat spog dat DNA heeltemal verwyder kan word sonder DNase 'n rampokker is.DNS is 'n relatief stabiele dubbelstringstruktuur, en dit kan nie uitgewis word deur net te praat en te lag nie.
Besoedeling assessering
assesseringsmetode: elektroforese-opsporing, 1% agarose, 6V/cm, 15min, laai 1-3 ul
Nukleïensuur kwantitatiewe analise
word gewoonlik met 'n UV-spektrofotometer gemeet.Laat ek eers die betekenis van die drie waardes van OD260, OD280 en OD230 gewild maak.
·OD260nm: Dit is die absorpsiegolflengte van die hoogste absorpsiepiek van nukleïensuur, en die beste gemete waarde wissel van 0.1 tot 1.0.Indien nie, verdun of konsentreer die monster om dit binne bereik te bring.
·OD280nm: Dit is die absorpsiegolflengte van die hoogste absorpsiepiek van proteïen en fenoliese stowwe.
·OD230nm: Dit is die absorpsiegolflengte van die hoogste absorpsiepiek van koolhidrate.
Kom ons praat dan oor die rol van elke aanwyser.Vir A260 kan dit gebruik word om die opbrengs van nukleïensuur te meet.Wanneer OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.
Vir suiwerheid moet ons kyk na die verhoudings wat ons algemeen sien: OD260/280 en OD260/230.
·Suiwer DNA: OD260/280 is ongeveer gelyk aan 1.8.Wanneer dit groter as 1,9 is, dui dit aan dat daar RNA-besoedeling is, en wanneer dit minder as 1,6 is, dui dit aan dat daar proteïen- en fenolbesoedeling is.
·Suiwer RNA: 1.7
·OD260/230: Of dit nou DNA of RNA is, die verwysingswaarde is 2.5.Wanneer dit minder as 2,0 is, dui dit aan dat daar besoedeling van suiker, sout en organiese materiaal is.
RNA integriteit
Dit is baie belangrik om die integriteit van RNA te meet.Oor die algemeen is dit nodig om 'n RNA-denatureringsgel-eksperiment te doen om te kyk of die helderheid tussen 28S en 18S RNA 'n tweevoudige verhouding is.Wanneer die derde band 5S verskyn, beteken dit dat die RNA begin afbreek het, behalwe vir ongewerweldes.
Data vir RNA kwaliteit assessering: Benewens bogenoemde toetse, is daar ook 'n paar meer gevorderde instrument toetse in terme van RNA integriteit, soos die RQI integriteit toets van die Experion outomatiese elektroforese stelsel, wat kan opspoor of RNA onsigbaar afgebreek word.
In wetenskaplike navorsing is fluoresserende kwantitatiewe PCR 'n vergelyking tussen die teikengeen en die interne verwysingsgeen.Daarom, in die proses van RNA-monsterbewaring, RNA-ekstraksie, ens., is die primêre doel om die integriteit van RNA te verseker.
Hoe die integriteit van RNA die balans tussen die teikengeen en die interne verwysingsgeen beïnvloed, kan maklik uit die figuur hieronder verstaan word.Degradasie sal lei tot geen-onvoltooidheid, of dit nou die onvolledigheid van die interne verwysingsgeen of die onvolledigheid van die teikengeen is, dit sal 'n groot impak op die data hê.
Skematiese diagram van teikengeen en verwysingsgeen, moet nie waar wees nie
Inhibisietoets (of die CT-waarde onder hoë of lae konsentrasie of ander toestande onderdruk word)
Met hierdie figuur as 'n voorbeeld, is die Ct-waardes van die vyf krommes soos volg.Die verspreiding van CT-waardes tussen die kurwes is ongelyk, en die Ct-waardes word vertraag onder hoë en lae konsentrasies, wat die geval is van PCR-inhibisie.
Sleutelpunt: In die proses van RNA-ekstraksie moet ons wanopvattings laat vaar en korrektes vasstel.
Die verkeerde idee is: RNA-ekstraksie streef net na die opbrengs, en dink dat hoe groter die hoeveelheid RNA wat verkry word, hoe beter.Trouens, wanneer ons kwantifisering doen, as die aantal gene nie baie groot is nie, het ons nie veel RNA nodig nie.Die hoeveelheid RNA wat jy onttrek is meer as genoeg.
Die korrekte konsep is:RNA-ekstraksie moet suiwerheid, integriteit en konsekwentheid nastreef.Suiwerheid kan verseker dat die daaropvolgende omgekeerde transkripsie nie geïnhibeer word nie en die data sal nie deur DNA beïnvloed word nie.Integriteit verseker die balans van teikenreekse en interne verwysings.Konsekwentheid verseker stabiele monsterlaai.
MIQE (4) – omgekeerde transkripsie
Wanopvatting: die strewe na hoër monstervolume.
Korrekte konsep: Streef na konsekwentheid (stabiliteit), ongeag die hoeveelheid RNA wat gelaai is, die doeltreffendheid van omgekeerde transkripsie bly konsekwent, om te verseker dat verskille in cDNA werklik verskille in mRNA kan weerspieël.
Ons verduidelik hierdie proses met 'n skematiese diagram:
Skematiese diagram van omgekeerde transkripsie doeltreffendheid, moenie waar wees nie
Eerstens moet ons die verskil tussen die omgekeerde transkripsieproses en die PCR-proses verstaan.PCR ondergaan veelvuldige verhittings- en uitgloeiingsprosesse, en die teikenfragment groei eksponensieel;terwyl omgekeerde transkripsie nie hierdie proses het nie, kan ons ons voorstel dat omgekeerde transkripsie eintlik een-tot-een is Tydens die replikasieproses, soveel stukke RNA
aangesien daar soveel stukke cDNA-inligting kan kry, moet dit nou verstaan word, want groot en klein fragmente is omgekeerd getranskribeer, en dit is onmoontlik om op een fragment te fokus.En omdat die hoeveelheid RNA relatief klein is, is die hoeveelheid cDNA wat verkry word ook relatief klein, anders as PCR, wat 'n amplifikasie-effek het, dus is dit basies onmoontlik om op te spoor.
cDNA elektroforese resultate
Tweedens, ideaal gesproke, word omgekeerde transkripsie een-tot-een uitgevoer, maar geen omgekeerde transkripsie van enige maatskappy kan hierdie effek bereik nie.Basies dwaal die doeltreffendheid van die meeste omgekeerde transkriptases tussen 30-50%.As dit die geval is, sal ons eerder 'n relatief stabiele omgekeerde transkripsie-doeltreffendheid hê, wat is wat ons in die figuur wil sien: 3 RNA's kry 2 cDNA's, 6 RNA's kry 4 cDNA's, dus maak nie saak hoeveel monster gelaai word nie, die omgekeerde transkripsie-doeltreffendheid is relatief stabiel.Ons wil nie die situasie sien waar omgekeerde transkripsie-doeltreffendheid onstabiel is en hoë konsentrasie geïnhibeer word nie.
So, hoe om te verifieer of die omgekeerde transkripsie-doeltreffendheid stabiel is?Die metode is baie eenvoudig, jy hoef net 'n vergelykingstoets te doen: een is om omgekeerde transkribeer na cDNA na verdubbeling van verdunning van RNA, en die ander is om verdubbeling verdunning te maak na omgekeerde transkripsie in cDNA, en doen dan qPCR om die verkrygde helling te sien Is dit konsekwent.As 'n topstudent behoort jy dit binne sekondes te verstaan.Soos hieronder getoon:
Verdunning van RNA en cDNA om te toets of die doeltreffendheid van omgekeerde transkripsie stabiel is
Omgekeerde transkripsie en kit
Hoe kan volmaakte fluoresserende kwantitatiewe PCR uitstekende omgekeerde transkripsie en kit hê.Omgekeerde transkripsie word rofweg in twee tipes verdeel volgens die bron, AMV ofM-MLV, en hul prestasie is dieselfde as wat in die tabel getoon word.
RNase H aktiwiteit
RNase H is Ribonuklease H, die Chinese naam is ribonuklease H, wat 'n endoribonuklease is wat spesifiek RNA in die DNA-RNA hibriede ketting kan hidroliseer.RNase H kan nie die fosfodiesterbindings in enkel- of dubbelstring DNA of RNA hidroliseer nie, dit wil sê, dit kan nie enkel- of dubbelstring DNA of RNA verteer nie.Word algemeen gebruik in die sintese van die tweede string van cDNA.
Dis 'n vreemde ding.Ons sê dat omgekeerde transkriptase RNase H-aktiwiteit het, nie dat omgekeerde transkriptase RNase H bevat nie, en dit is dalk nie moontlik om RNase H van omgekeerde transkripsie te skei nie, miskien as gevolg van die konformasie van sekere groepe in omgekeerde transkriptase. Hierdie aktiwiteit word veroorsaak deur die omgekeerde transkriptase.
Daarom, ongeag die hoër omgekeerde transkripsie-doeltreffendheid van AMV, verminder sy RNase H-aktiwiteit die opbrengs van cDNA.Natuurlik optimaliseer reagensvervaardigers voortdurend hul produkte om RNase H-aktiwiteit in omgekeerde transkriptase soveel as moontlik uit te skakel om die opbrengs van cDNA te verhoog.
Uitgloeiingstemperatuur
Sekondêre struktuur van RNA by verskillende temperature
Sien die figuur hierbo vir die sekondêre struktuur van RNA by verskillende temperature, en gebruik die mFold aanlyn hulpmiddel om die sekondêre struktuur van die teiken fragment onder spesifieke temperatuur en sout konsentrasie toestande te bepaal.By 55°C is die sekondêre struktuur van die RNA steeds baie kompleks, omgekeerde transkriptase kan nie werk nie, en die sekondêre struktuur kan nie heeltemal opgelos word tot 65°C nie, terwyl die optimum temperatuur van AMV en M-MLV veel laer as hierdie temperatuur is.
wat om te doen?Die sekondêre struktuur is die komplementêre paring van die sjabloon self, wat lei tot sterk mededinging tussen die primer en omgekeerde transkripsie en die sjabloon, wat lei tot 'n reeks probleme soos lae E en swak herhaalbaarheid.
wat om te doen?Verhoog net die uitgloeitemperatuur soveel as moontlik.
Baie reagensvervaardigers verbeter hul omgekeerde transkripsie deur genetiese ingenieurswese.Sommige verhoog die reaksietemperatuur, soos Jifan en Aidelai, en sommige verwyder die aktiewe groep RNase H-ensiem om die affiniteit tussen die ensiem en die RNA-sjabloon te verbeter.Hoë affiniteit kan mededingend die sekondêre struktuur uitdruk en glad deurlees, en ook die doeltreffendheid van omgekeerde transkripsie aansienlik verbeter.
Sleutelpunt: Omgekeerde transkripsie is belangriker om die konsekwentheid van omgekeerde transkripsie-doeltreffendheid na te streef (ensieme moet nie net doeltreffend wees nie, maar ook stabiel), eerder as die hoeveelheid monster wat gelaai is, as dit nie 'n besonder grootskaalse fluoresserende kwantitatiewe PKR is nie, sal dit glad nie moontlik wees nie.Veelvuldige cDNA's.
Verskeie vervaardigers het ook pogings aangewend in die strewe na konsekwentheid.Byvoorbeeld, die meeste maatskappye het nou omgekeerde transkripsie verpak as 'n standaardstel te koop, wat 'n goeie keuse is.
Byvoorbeeld, Foregene se RT Easy Series-stelle:
RT Easy I (Meestervoormengsel vir eerste string cDNA-sintesestel)
MIQE (5) – teikengeeninligting
Die bostaande figuur verduidelik
1. Of hierdie geen effektief is vir herhaalde eksperimente kan oor die algemeen deur herhaalde eksperimente geverifieer word.
2. Gene ID, jy weet.
3. Geenlengte, die totale lengte van die teikengeen is beslis geen probleem nie.Wanneer primers ontwerp word, maak seker dat die lengte van die amplikon tussen 80-200bp is om 'n beter amplifikasiedoeltreffendheid te verseker.
4. Opeenvolging Blast vergelyking inligting, die teiken geen moet vergelyk word in genebank om nie-spesifieke amplifikasie te voorkom.
5. Teenwoordigheid van pseudogene.'n Pseudogeen is 'n DNS-volgorde soortgelyk aan 'n normale geen, maar verloor sy normale funksie.Dit bestaan dikwels in die multi-geen familie van eukariote.Dit word gewoonlik deur ψ voorgestel.Dit is 'n nie-funksionele genomiese DNA-kopie in die genoom wat baie soortgelyk is aan die koderende geenvolgorde., word oor die algemeen nie getranskribeer nie, en het geen duidelike fisiologiese betekenis nie.
6. Posisie van primers relatief tot eksons en introne.In die vroeë jare, toe ons die probleem van DNA-besmetting opgelos het, het ons dikwels aandag gegee aan die posisies van primers, eksons en introne, en oor die algemeen oorweeg om primers oor introne te ontwerp om DNS-amplifikasie te vermy.Sien asseblief die figuur hieronder: swart verteenwoordig introne, verskeie bloue verteenwoordig eksons, pienk verteenwoordig algemene primers, en helderrooi verteenwoordig intron-spannende primers.
Skematies, nooit waar nie
Wat 'n perfekte plan lyk dit tog, maar in die meeste gevalle is die trans-intron-inleiders nie so magies soos voorgestel nie, en hulle sal ook nie-spesifieke amplifikasie veroorsaak.Die beste manier om DNS-besmetting te voorkom, is dus om DNS heeltemal te verwyder.
7. Konformasie voorspelling.Deur hierdie voorbeeld weer te gebruik, gebruik die mFold-aanlyninstrument om die sekondêre struktuur van die teikenfragment by 'n spesifieke temperatuur en soutkonsentrasie te bepaal.
Sekondêre struktuur van RNA by verskillende temperature
Die sekondêre struktuur is die komplementêre paring van die sjabloon self, wat sal lei tot sterk mededinging tussen die primer en sjabloonparing, en die kanse op primer binding is minder, wat lei tot 'n reeks probleme soos lae E en swak herhaalbaarheid.Deur middel van sagteware voorspelling, as daar geen sekondêre struktuurprobleem is nie, sal dit wonderlik wees.As daar is, sal ons opvolgartikel spesifiek bespreek hoe om hierdie probleem op te los.
MIQE (6)—qPCR Oligonukleotiede
Vir fluoresserende kwantitatiewe PCR, die eerste ding waarmee jy elke dag sukkel, is RNA-ekstraksie, en die tweede ding kan primer-ontwerp wees.
Eerstens gaan ons steeds die reëls oor onderlaagontwerp na volgens die MIQE-kontrolelys.Dit is so eenvoudig dat die skelms kan lag, en ons kan dit in een sin voltooi: vind die volgorde en posisie van die primer-sonde en die modifikasiemetode uit.Vir die primer suiweringsmetode is primer sintese tans so goedkoop, qPCR is waardig vir PAGE en bogenoemde suiweringsmetodes, en die inligting van die sintese-instrument is nie belangrik nie.Baie mense doen al dekades primers en weet nie dat die sintetiseerder ABI3900 is nie.
Wat die beginsels van onderlaagontwerp betref, hoef jy dit nie by wyse van spreke te memoriseer nie, want die meeste onderlaagontwerpsagteware of aanlynhulpmiddels kan hierdie probleme hanteer (aanbevole aanlynhulpmiddel primer3.ut.ee/), en 99,999% van onderlaagontwerp word nie met die hand gedoen nie. Kyk, die skrywer ontwerp soms honderde onderlaag-ontwerpe per dag, as jy lees, sal dit een vir een word.
Kontroleer net die volgende punte nadat die onderlaag ontwerp is:
1. Ontwerp primers naby aan die 3'-kant: In die geval van die gebruik van oligo dT-inleiders vir cDNA eerste-string sintese, met inagneming van die omgekeerde transkripsie-doeltreffendheid en RNA-integriteit, moet die ontwerpte primers naby die 3'-punt ontwerp word om amplifikasie-doeltreffendheid te verbeter.Gebruik 'n prentjie om soos volg te verduidelik (daar is geen manier om dit te verstaan nie):
Hoekom moet primers naby aan die 3′-kant ontwerp word, dit moet nie waar wees nie
2. TM-waarde: Die Tm-waarde is by 55-65°C (omdat die eksonuklease-aktiwiteit die hoogste is by 60°C), en die GC-inhoud is by 40%-60%.
3. BLAST: Ten einde nie-spesifieke amplifikasie van die genoom te vermy, moet Blast vir aanvullende verifikasie gebruik word.
MIQE(7)—qPCR-proses
1. qPCR-stel
Volgens die vereistes van MIQE moet ons die volledige reaksietoestande in die artikel duidelik beskryf, insluitend die konfigurasie van die PCR-reaksiestelsel, watter stel gebruik word, wie is die vervaardiger, hoe groot is die reaksiestelsel, of die kleurstofmetode of die sondemetode gebruik word, PCR-programinstellings.Veteraanbestuurders sal beslis vind dat solank die kit gekies word, bogenoemde inligting basies bepaal word.
Tans is die vervaardiging en vervaardiging van fluoresserende kwantitatiewe PCR-stelle 'n baie volwasse tegnologie.Solank jy nie uiters slegte vervaardigers kies nie, is die waarskynlikheid van probleme nie hoog nie, maar ons wil tog 'n paar punte met jou deel:
Warmbegin Taq-ensiem:Die belangrikste deel van PCR is die warmstart-Taq-ensiem.Die warmbegin-ensieme op die mark word oor die algemeen in twee tipes verdeel, een is 'n chemies gemodifiseerde warmbegin-ensiem (jy kan dit voorstel as paraffien-inbedding), en die ander is 'n warmbegin-ensiem vir teenliggaammodifikasie (antigeen-teenliggaambinding).Chemiese modifikasie is 'n vroeë manier om ensieme warm te begin.Wanneer 'n sekere temperatuur bereik word, sal die ensiem sy aktiwiteit vrystel.Die teenliggaam-gemodifiseerde warmbegin-ensiem gebruik biologiese metodes om die aktiwiteit van die ensiem te blokkeer.Wanneer 'n sekere temperatuur bereik word, sal die teenliggaam gedenatureer en as 'n proteïen geïnaktiveer word, en die ensiemaktiwiteit sal in werking gestel word.
Wat is egter die nut hiervan?Dit is die geval, die vrystellingsaktiwiteit van teenliggaam-gemodifiseerde ensieme is vinniger as dié van chemies gemodifiseerde ensieme, so wat sensitiwiteit betref, het teenliggaam-gemodifiseerde ensieme 'n effense voordeel, sodat daar basies geen chemies gemodifiseerde ensieme in die kits op die mark is nie.As daar is, dan is hierdie vervaardiger se tegnologie steeds vas in die era van die millennium.
Magnesiumioonkonsentrasie:Magnesiumioonkonsentrasie is baie belangrik in die PCR-reaksie.Gepaste magnesiumioonkonsentrasie kan die vrystelling van Taq-ensiemaktiwiteit bevorder.As die konsentrasie te laag is, sal die ensiemaktiwiteit aansienlik verminder word;as die konsentrasie te hoog is, sal die ensiem-gekataliseerde nie-spesifieke amplifikasie verbeter word.Die konsentrasie van magnesiumione sal ook die uitgloeiing van primers, die smelttemperatuur van die templaat en PCR-produkte beïnvloed, en daardeur die opbrengs van geamplifiseerde fragmente beïnvloed.Die konsentrasie magnesiumione word gewoonlik teen 25mM beheer.Natuurlik, vir 'n goeie kit, moet die konsentrasie van magnesiumione goed beheer word.Sommige handelaars voeg 'n magnesiumioon chelaatmiddel by die reagens, wat die effek van outomatiese aanpassing van die magnesiumioonkonsentrasie kan bereik.
Fluorescerende kleurstofkonsentrasie:Fluorescerende kleurstof, wat die SYBR Green is wat ons gewoonlik gebruik, genereer hoofsaaklik fluoressensie deur aan die klein groef van dubbelstring DNA te bind, want die binding van die kleurstof aan dubbelstring DNA is nie-spesifiek, dit wil sê Solank as wat dubbelstring DNA daarmee gekombineer word, kan fluoressensie plaasvind, so sal primer-dimere dit kombineer met primer-dimere en agtergrondsjablone.
NS: As gevolg van sy ligsensitiewe eienskappe, word produkte op die mark oor die algemeen in bruin ondeursigtige sentrifugebuise verpak (soos in die prentjie hieronder getoon).Dit sal egter 'n probleem ondervind.Dit is moeilik om te sien of die vloeistof gesuig word tydens monsterneming.In hierdie opsig is Qingke inderdaad die mees gebruikersvriendelike (soos in die prentjie hieronder getoon), en die deursigtige buis word in 'n ondeursigtige bliksak verpak.Plaas dit dan in 'n bliksak, met inagneming van die gerief om lig en monsterneming te vermy.Jy moet die regte produknommer kies.TSE204 is 'n super kostedoeltreffende bestaan, wat my lus maak om gras te plant.
Die konsentrasie van die fluoresserende kleurstof is ook baie belangrik.As die konsentrasie te laag is, sal die versterkingskurwe nie in die latere stadium opgaan nie en is dit nie perfek nie;as die konsentrasie te hoog is, sal dit geraasinterferensie veroorsaak.Aangesien die fluoresserende kwantitatiewe PKR hoofsaaklik afhang van die CT-waarde, as die konsentrasie van die fluoresserende kleurstof nie behoorlik aangepas word nie, is die laagtepunt beter as die hoogtepunt.Natuurlik is die toepaslike kleurstofkonsentrasie die beste.
ROX: ROX kleurstowwe word gebruik om reg te stel vir goed-tot-put fluoressensie seinfoute.Sommige instrumentvervaardigers vereis kalibrasie, terwyl ander nie.Byvoorbeeld, die gebruik van Thermo Fisher Scientific se Real Time PCR-versterkingsinstrument vereis gewoonlik kalibrasie, insluitend 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, ens. Die algemene stelinstruksies sal dit beskryf.
Foregene se qPCR Mix bevat ook ROX-kleurstof, wat gerieflik is vir gebruik in verskeie modelle.
Swak waterstofbinding behandeling: Die behandeling van swak waterstofbindings is 'n relatief tegniese saak.Niks het die handleidings van baie kits gelees nie, maar nie een van hulle het hierdie onderwerp genoem nie.Eintlik is dit so belangrik.Die kombinasie van basisse hang hoofsaaklik af van die sterkte van waterstofbindings.Sterk waterstofbindings is normale amplifikasie, en swak waterstofbindings lei tot nie-spesifieke amplifikasie.As swak waterstofbindings nie goed uitgeskakel kan word nie, kan nie-spesifieke amplifikasie nie vermy word nie.Binne die bestek van die skrywer het slegs 'n paar maatskappye hierdie probleem opgemerk.Wanneer jy die kit koop, kan jy verwys na of jy 'n oplossing in hierdie verband oorweeg het vir die stel wat jy wil kies.
Reaksie volume: Die 20-50ul-stelsel word meer algemeen gebruik, en kleiner volumes sal waarskynlik foute veroorsaak.Oor die algemeen sal die kit-instruksies die gebruik van PCR-reaksievolumes aanbeveel.Moenie slim wees en kleiner volumes gebruik om koste te bespaar nie.die doel van.Die volume wat deur die handelaars aanbeveel word, is eintlik getoets, en dit kan wees dat hulle nie die probleem van foute wat deur klein volumes veroorsaak word, kan oplos nie.
2. Die vervaardiger en artikelnommer van die buisplaat
Almal ken die beginsel van fluoresserende kwantitatiewe PCR.Fluoresentasieversameling word hoofsaaklik deur PCR-buisdoppies uitgevoer.Let op twee punte wanneer u PCR-verbruiksartikels kies: goeie ligtransmissie en geskik vir die instrument.Oor die algemeen is die planke en buise van hoofstroom handelsmerke goed, maar jy moet versigtig kies wat aanpassing betref, anders sal jy nie die instrument kan gebruik nie.
4. Topvlak kennis
MIQE (8)—qPCR-bekragtiging
Dit is die topprioriteit van qPCR!Soveel helde het hier in die sand geval.Dit is natuurlik ook moontlik dat jy gelukkig is en die gene wat jy bestudeer het is eenvoudig, so jy het deur die ysgrot langs die wind gesweef.Die verifikasie-inligting van qPCR is bedoel om die betroubaarheid van die data te toets.Ons lys die nodige verifikasie-inligting soos volg:
1.Spesifisiteitstoets
Die spesifisiteit van teikengeenamplifikasie word getoets deur te kontroleer of die elektroforesebeeld 'n enkele band is;volgordeverifikasie;smeltkurwe om te sien of die piekkaart enkel is;ensiem vertering verifikasie en ander metodes.
Hier fokus ons op tdie ontleding van nie-spesifieke amplifikasie deur die metode van smeltkurwes te gebruik.Oor die algemeen, wanneer ons primers ontwerp, moet die grootte van die produkfragment in die reeks van 80-200bp wees, wat die smelttemperatuur van die PCR-produk 80-85 °C bereik.As daar dus diverse pieke is, moet daar ander nie-spesifieke amplifikasieprodukte wees;as die piek onder 80°C verskyn, word dit oor die algemeen as 'n primer dimeer beskou;as die piek bo 85°C verskyn, word dit oor die algemeen beskou as DNA-kontaminasie of meer nie-spesifieke amplifikasie van groot fragmente.
Let wel: Soms is daar net 'n enkele piek by 80°C.Op hierdie tydstip moet hierdie konsep nagekom word.Dit is waarskynlik dat die amplifikasieresultate almal primer dimere is.
Normale smeltkurwe (enkele piek met geen nie-spesifieke versterking)
Problematiese smeltkurwe (nie-spesifieke versterking van valse pieke)
【Gevalleontleding】
Daar is 'n hoofpiek, maar die primer dimeer is ernstig
Die enkelpiek-smeltkromme in die figuur hieronder kan jou oë maklik bedrieg deur te dink dat dit 'n perfekte eksperiment is, maar die resultaat is heeltemal verkeerd.Op hierdie tydstip moet ons na die smelttemperatuur kyk.Die piektemperatuur is onder 80°C, wat heeltemal primer-dimeer is.
Geen teikenfragment nie, alle primer dimere
Hier kan my broer nie ophou nie.Die foto hieronder is 'n foto wat geneem is met 'n selfoon wat deur 'n skelm aan my gestuur is.Die reagense wat hy gebruik het, is almal handelsmerke wat algemeen in die bedryf gebruik word.Hy het van een T-voorvoegsel-handelsmerk na 'n ander T-voorvoegsel-handelsmerk verander.Ek dink jy het dit al geraai.Die skelm het vir my gehuil: “Die reagens wat in die eerste foto gebruik is, is te goed, en die piek is enkel.Later, na die gebruik van die reagens wat jy aanbeveel het, word dit soos die tweede prentjie, met gemengde pieke.Jy het my ellendig gemaak.“
Skei die twee grafieke.Met die eerste oogopslag het een 'n enkele piek, en die ander het 'n dubbele piek.Onsin, 'n enkele piek is natuurlik goed.Is dit waar?
Erger as Dou E, as ek die twee prentjies in die prentjie hieronder plaas, sal jy dadelik verstaan.Trouens, ons word maklik verlam deur hierdie soort prentjie.Na noukeurige ontleding het ons gevind dat: die piek van die eerste figuur by 75°C is, wat heeltemal primer dimeer is;die piek van die tweede figuur verskyn by 75°C en 82°C, ten minste is daar Die produk verskyn.
Foto's van terugvoer van studente
Die fundamentele probleem is dus nie die probleem van reagense nie, maar die probleem van onderlaagontwerp.Terselfdertyd bewys dit ook dat sommige groot handelsmerke nie van ystergehalte is nie, en dit bewys ook wat my broer voorheen gesê het: Dit is nie die reagenshandelsmerk wat jou artikel ondersteun nie.Dit is jou artikel wat die handelsmerk van reagense ondersteun het.Stel jou net voor, as die skelm nie die reagense verander het nie, sou die verkeerde data na die joernaal gestuur word, en wat sou gebeur sou 'n tragedie wees.
2. Ct waarde van blanko kontrole
Moenie verduidelik nie, as die blanko kontrole 'n Ct-waarde het, is dit nie besoedeling nie?Jy moet egter steeds verstaan watter leë kontrole 'n Ct-waarde het.As dit NTC is, beteken dit dat daar vreemde DNA is soos reagensbesoedeling.As dit NRT is, beteken dit dat die onttrekte RNA DNA-besmetting het.
3. Standaardkurwe
Insluitend die helling en berekeningsformule, kan die PKR-doeltreffendheid deur die formule bereken word.'n Perfekte eksperiment vereis dat die helling van die standaardkromme 3,32 nader, en R² om 0,9999 te nader.
4. Lineêre dinamiese omvang
Die dinamiese omvang van die reaksie is lineêr.Volgens die sjabloon wat gebruik word om die standaardkromme te genereer, moet die dinamiese reeks ten minste 5 konsentrasiegradiënte insluit, en aandag gee aan die verandering van Ct-waardes by hoë konsentrasiegradiënte en lae konsentrasiegradiënte.
5. Opsporing akkuraatheid
Veranderinge in qPCR-resultate, dit wil sê swak herhaalbaarheid, dit wil sê swak presisie, word veroorsaak deur baie faktore, insluitend temperatuur, konsentrasie en werking.qPCR-presisie word gewoonlik minder beheerbaar namate kopiegetal afneem.Ideaal gesproke binne-eksperimentele variasie, moet hierdie tegniese variasie onderskei word van biologiese variasie, en biologiese herhalings kan statistiese verskille in qPCR-resultate tussen groepe of behandelings direk aanspreek.Veral vir diagnostiese toetse, moet die beste inter-toets akkuraatheid (herhaalbaarheid) oor terreine en operateurs gerapporteer word.
6. Opsporingsdoeltreffendheid en LOD (in multiplex qPCR)
LOD is die laagste konsentrasie van 95% van positiewe monsters wat opgespoor is.Met ander woorde, die konsentrasie van LOD vervat in 'n stel teikengeen-herhalings moet nie 5% van die mislukte reaksies oorskry nie.Wanneer multipleks qPCR-analise gedoen word, veral vir gelyktydige opsporing van puntmutasies of polimorfismes, moet multipleks qPCR bewys lewer dat die akkuraatheid van veelvuldige teikenfragmente nie in die gedrang kom in dieselfde buis nie, meervoudige opsporing en enkelbuisopsporing Doeltreffendheid en LOD moet dieselfde wees.Veral wanneer hoë-konsentrasie-teikengene en lae-konsentrasie-teikengene gelyktydig geamplifiseer word, moet aan hierdie probleem aandag gegee word.
Probleme en oplossingsOor die algemeen konsentreer die probleme wat dikwels in qPCR-ontfouting voorkom op die volgende aspekte:
·niespesifieke amplifikasie
·Moeilike keuse van onderlaagkonsentrasie en probleme met onderlaagdimere
·Die uitgloeitemperatuur is onakkuraat
·Sekondêre struktuur beïnvloed versterkingsdoeltreffendheid
nie-spesifieke versterking
nie-spesifieke versterkingvoorkom, word dit oor die algemeen oorweeg of die onderlaagontwerp nie geskik is nie, maar as jy nie haastig is om die onderlaag te verander nie, kan jy eers die volgende metodes probeer (die beginsel is ook aangeheg):
·Verhoog die uitgloeitemperatuur – probeer om swak waterstofbindings te maak wat nie in stand kan bly nie;
·Verkort uitgloei- en verlengingstyd – verminder die kans op swak waterstofbindings;
·Verminder primerkonsentrasie – verminder die kans op binding van oortollige primers en nie-teikenstreke;
Lae versterkingsdoeltreffendheid
Die teenoorgestelde situasie as nie-spesifieke amplifikasie – lae versterkingsdoeltreffendheid, en die maatreëls om lae versterkingsdoeltreffendheid te hanteer, is net die teenoorgestelde:
·Verleng die uitgloei- en verlengingstyd;
· Verander na drie-stap PCR en verminder die uitgloei temperatuur;
·Verhoog die onderlaagkonsentrasie;
Ps: Baie nagraadse studente wat in die 90's gebore is, is nie bereid om te studeer hoe om eksperimente te ontfout nie, en hoop dat die stel die probleem heeltemal kan oplos (as jy na 'n reagensmaatskappy wil gaan om navorsing en ontwikkeling te doen na die gradeplegtigheid), eintlik dink die reagensvervaardigers ook so, ek hoop dit is 'n dwaas. absorpsie faktore.Om die probleem maklik op te los, moet dwase steeds die bekendstelling van die reagensmaatskappy lees om te sien of daar 'n faktor is wat swak waterstofbindings absorbeer.
Moeilike keuse van onderlaagkonsentrasie en probleme met onderlaagdimere
Metode 1: Oor die algemeen het die stelinstruksies vir qPCR aanbevole stelsels en aanbevole onderlaagkonsentrasies.
Metode 2: Ontfouting deur die primerkonsentrasiegradiënt in te stel.Die foto hieronder is van 'n maatskappy gesteel om te illustreer.Die figuur hieronder toon die fluoressensie-kwantitatiewe resultate wat gemaak is met drie onderlaagkonsentrasiegradiënte (100nM, 250nM, 500nM) en vier templaatkonsentrasiegradiënte (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Die Ct-waarde van die eksperimentele resultate word soos volg geplot:
Seleksie van onderlaagkonsentrasie Verbind elke onderlaagkonsentrasie in 'n lyn soos volg:
Die keuse van primerkonsentrasie is voor die hand liggend, die lineêre verwantskap van die primerkonsentrasie van 100nM en 250nM is beter, en die lineêre verband van die primerkonsentrasie van 500nM is relatief swak.In 100nM en 250nM is die Ct-waarde van 250nM relatief klein, dus is die optimale primerkonsentrasie 250nM.Oor die algemeen kan ernstige primer-dimere in die smeltkurwe gesien word.Wat as die ontwerpte primers nie primer-dimers kan vermy nie?
Metode 3: Verminder die hoeveelheid primers en verhoog die uitgloeitemperatuur (nie nodig om te verduidelik nie).
Die empiriese waarde van die uitgloeitemperatuur is 60°C.As jy nie seker is nie, hoe om 'n meer geskikte uitgloeitemperatuur te kies?Die antwoord is dieselfde as die keuse van onderlaagkonsentrasie –gradiënt toets.Neem 'n foto van Bio-rad maatskappy om die probleem te illustreer.Vir die amplifikasie van 'n sekere teikenfragment, stel agt temperatuurgradiënte, elk met drie herhalings, en die verkrygde amplifikasiekurwe is soos volg:
seleksie van uitgloeitemperatuur:
·70°C, 69°C—Basies kan die primers nie gekombineer word nie, so daar is geen amplifikasie nie.
·67.3°C – Daar is 'n klein hoeveelheid versterking aan die begin, en die Ct-waarde is relatief groot.
·64.5°C——Die Ct-waarde neem af.
· By 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C en 55.0°C was die Ct-waardes basies geneig om stabiel te wees, maar die finale fluoressensiewaardes was anders.
Hoe om te kies?Beginsel: Die eerste beginsel is die hoër Ct-waarde.Vir dieselfde Ct-waarde, kies 'n hoër uitgloeitemperatuur om dimerisasie en nie-spesifieke amplifikasie te vermy.Alhoewel daar 'n hoër fluoressensiewaarde by 55°C is, kan daar dimere of nie-spesifieke amplifikasie daarin wees.
Maar as jy so slim soos jy is, sal jy beslis dink: Logies gesproke, as die PCR-reaksie baie spesifiek is, solank die onderlaagkonsentrasie die minimum vereiste oorskry, behoort die hoë en laagtepunte geen effek te hê nie, net soos fluoresserende kleurstowwe en dNTP's.Inderdaad, solank as wat die uitgloeitemperatuur behoorlik geoptimeer is, sal die effek van onderlaagkonsentrasie op Ct-waarde natuurlik tot die minimum beperk word.
Die uitgloeitemperatuur is behoorlik geoptimaliseer, en die effek van onderlaagkonsentrasie op CT sal tot die minimum beperk word
Sekondêre struktuur beïnvloed versterkingsdoeltreffendheid
Kom ons neem die foto uit Bio-rad om die probleem te illustreer.Dit ontwerp ook 'n temperatuurgradiënt om 'n geen met 'n sekondêre struktuur te versterk.
Sekondêre struktuur kom na vore
Dit kan gesien word dat namate die temperatuurgradiënt afneem, produkte begin verskyn en die Ct-waarde vorentoe beweeg en die minimum waarde by 60.7°C bereik, en dan soos die temperatuurgradiënt afneem, word die Ct-waarde groter.Omgekeerd, soos die temperatuur toeneem, gaan die sekondêre struktuur oop en neem die versterkingsdoeltreffendheid toe.Nadat 'n sekere temperatuur bereik is, kan die verhoging van die temperatuur nie die versterkingsdoeltreffendheid verbeter nie.Omdat die primers nie op hierdie stadium stabiel gekombineer kan word nie.Daarom,soek die temperatuur met die laagste Ct-waarde, wat die beste temperatuur is om die sekondêre struktuursjabloon te versterk!Natuurlik moet slim dwase weet dat as dit nie nodig is nie, dit die beste is om die primers te verander en die sekondêre struktuurstreek te vermy.
5. Toepassingsvlak
MIQE—Data-analise
Die data-analise word hoofsaaklik deur die fluoresserende kwantitatiewe PCR-instrument gegee.In die vorige artikel is baie data-ontledingswerk gedoen, soos die blanko-kontrole, wat in die ontwerp van die eksperiment verduidelik is.Die interne verwysingsgene, herhalingsgetalle, ens. is uitgeklaar., hier verduidelik ons hoofsaaklik die toepassing van qPCR.
qPCR word wyd gebruik, en eksperimentele verifikasie en nukleïensuurdiagnose is die mees gebruikte scenario's.
absolute kwantifisering
Log (aanvanklike konsentrasie) het 'n lineêre verband met die aantal siklusse.'n Standaardkurwe kan getrek word vanaf 'n standaard met 'n bekende aanvanklike kopiegetal, dit wil sê die lineêre verwantskap van die amplifikasiereaksie kan verkry word.Volgens die Ct-waarde van die monster kan die konsentrasie in die monster bereken word.Die hoeveelheid sjablone wat ingesluit moet word.
Absolute Kwantitatiewe Berekeningsmetode
Absolute kwantifisering moet op die standaardkromme gebaseer word.Om 'n standaardkromme te maak, word 'n standaard vereis.Gewoonlik is die standaard 'n plasmied wat verkry word deur die teikengeen te kloneer.Hoekom is dit 'n plasmied?Omdat sirkelvormige plasmied DNA die mees stabiele is.Verdun die standaardproduk in 5 tot 6 gradiënte volgens die verdubbelingsverhouding (10-voudige verdunning), en let op die eenvormigheid wanneer verdun word.Laat die Ct-waarde tussen 15-30 val.
Standaard voorbereiding
Terselfdertyd moet die monster wat getoets moet word ook dienooreenkomstig verdun word (onthou die verdunningsfaktor), en die Ct-waarde moet ook tussen 15-30 val.Die standaardproduk + die monster wat getoets moet word, word saam op die masjien geplaas.Na die lopie is 'n standaardkurwe met die standaardstof gemaak, en die monsters wat getoets moet word, is in die standaardkurwe ingebring om die konsentrasie te bereken.
Hepatitis B-virus HBV-kwantifisering is 'n tipiese absolute kwantifisering, wat die viruskopiegetal in 1 ml bloed kan bereken.
Berekening van kopienommer
Monsterkonsentrasie wat getoets moet word (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × verdunningsfaktor
Monster molekulêre gewig = aantal basisse × 324
Die kopienommer van die monster wat getoets moet word (kopieë/ul) = die konsentrasie van die monster wat getoets moet word / die molekulêre gewig van die monster × 6 × 1014
Berekeningsmetode van kopienommer
Bogenoemde is die berekeningsmetode vir die bepaling van die hoeveelheid.Dit is 'n wiskundige probleem wat opgelos kan word nadat jy van junior hoërskool gegradueer het, en wiskundige probleme word oor die algemeen deur rekenaars opgelos.As jy nie verstaan nie, kan jy kom kommunikeer.
relatiewe kwantifisering
Relatiewe kwantifisering word hoofsaaklik in wetenskaplike navorsing gebruik.Hoeveel virusse is daar in 1ml bloed, en dit is 'n DNS-virus, dit is 'n relatief deterministiese gebeurtenis: die hoeveelheid bloed kan bepaal word, en die DNS-virus is relatief stabiel.Dit is egter moeilik vir ons om die aantal transkripsie-kopieë van 'n sekere geen in 'n blaar te vergelyk, want dit is moeilik om die grootte, gewig en sagtheid van die blaar te bepaal, die hoeveelheid onttrekte RNA is moeilik om te bepaal, en die doeltreffendheid van omgekeerde transkripsie is ook moeilik om te bepaal, dit wil sê, enige stap kan veroorsaak dat die eksperimentele data foute het en nie gebruik kan word nie.
Daarom moet relatiewe kwantifisering 'n element invoer:die interne verwysingsgeen .
Met ander woorde, relatiewe kwantifisering is eintlik 'n vergelyking tussen die teikengeen en die interne verwysingsgeen.In vergelyking in dieselfde weefsel en dieselfde sel, is die invloed van monstergrootte, RNA-ekstraksiehoeveelheid, omgekeerde transkripsiedoeltreffendheid en PKR-doeltreffendheid relatief klein.As gevolg van die klein steekproefgrootte, is beide interne verwysingsgene en teikengene relatief verminder.Dit is hoekom ons al voorheen eenvormigheid en stabiliteit beklemtoon het.
Interne verwysingsgene is oor die algemeenhuishoudelike gene(huishouding-gene), wat verwys na 'n klas gene wat stabiel in alle selle uitgedruk word, en hul produkte is nodig om die basiese lewensaktiwiteite van selle te handhaaf.
Moenie hierdie konsep verwar nie.Huishoudelike gene is biologiese funksieterme, terwyl interne verwysingsgene eksperimentele tegniese terme is.Huishoudelike gene moet validering slaag voordat hulle as interne verwysingsgene gekies kan word.
Ons het byvoorbeeld verskeie huishoudelike gene in die figuur hieronder geselekteer om hul uitdrukkingsvlakke in verskillende weefselselle te toets, en het gevind dat die uitdrukkingsvlakke van β-2-mikroglobulien heelwat verskil van dié van die ander drie gene, dus kon hulle nie as interne verwysingsgene gebruik word nie.
Nadat die regstellingsfunksie van die interne verwysingsgeen verstaan is, word twee algoritmes afgelei as gevolg van die bekendstelling van die interne verwysingsgeen.
·dubbelstandaardkrommemetode
·2 – △△Ct metode (CT waarde vergelyking metode)
As jy belangstel om spesies en geenfunksies te bestudeer, gee asseblief die navorsing oor algoritmes op en gebruik formules direk, of gebruik masjiene direk;as jy 'n reguit ou in wiskunde en ingenieurswese is, voel asseblief vry.
dubbel standaard kurwe metode
Kwantifiseer die teikengeen en huishoudingsgeen van die kontrolemonster en die monster wat getoets moet word deur die standaardkurwe, en bereken dan die relatiewe waarde volgens die berekeningsformule, wat die relatiewe uitdrukkingsvlak is.
Voordele: eenvoudige analise, relatief eenvoudige eksperimentele optimalisering
Nadeel: Vir elke geen moet elke rondte eksperimente 'n standaardkurwe maak
Toepassing: Een van die twee mees algemeen gebruikte en erkende relatiewe kwantitatiewe metodes in die studie van geenuitdrukking regulasie
Die formule is soos volg:
Voorbeelde is soos volg:
Bereken die relatiewe hoeveelheid gebaseer op die kwantitatiewe resultaat
2 – △△Ct metode (CT waarde vergelyking metode)
Voordele: Nie nodig om 'n standaardkromme te maak nie
Nadele: Daar word aanvaar dat die versterkingsdoeltreffendheid naby aan 100% is;die standaardafwyking is < 5%, en die standaardkurwe en die doeltreffendheid tussen elke versterking word as konsekwent aanvaar;die optimalisering van eksperimentele toestande is meer ingewikkeld.
Toepassing: Een van die twee mees algemeen gebruikte en erkende relatiewe kwantitatiewe metodes in die studie van geenuitdrukking regulasie
Natuurlik is die amplifikasiedoeltreffendheid gewoonlik onmoontlik om perfek 1 te wees. Korreksiemetode: As ons weet dat die teikengeen en die verwysingsgeen dieselfde amplifikasiedoeltreffendheid het, maar die amplifikasiedoeltreffendheid is nie gelyk aan 1 nie, dan kan 2－△△Ct gekorrigeer word as: (1+E )－△△Ct, as die korrekte amplifikasiedoeltreffendheid byvoorbeeld na 1 is, as die korrekte amplifikasiedoeltreffendheid byvoorbeeld 1 is. .95–△△Ct
Tot dusver het die inhoud oor fluoresserende kwantitatiewe PCR tot 'n einde gekom.
Postyd: Apr-06-2023
